一种转基因玉米nk603品系的lamp检测试剂盒及检测方法

文档序号:8425959阅读:341来源:国知局
一种转基因玉米nk603品系的lamp检测试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及转基因玉米品系的检测领域,具体涉及一种转基因玉米NK603品系的 LAMP试剂盒和检测方法。
【背景技术】
[0002] 转基因作物或基因修饰作物是通过导入外源基因并整合到基因组中,使某一或某 些性状得到改良的作物。转基因作物在提高抗性及改良品质上起到重要的作用。但是由于 转基因技术可能产生新毒素和过敏原、导致抗性基因的基因漂移等原因,国际社会对转基 因食品的安全性仍有相当大的争议。欧盟、美国、日本等国家都相继颁布了相关法令,对转 基因作物及其衍生食品进行标识管理,并对阈值作了相关规定。我国卫生部也于2002年出 台了《转基因食品卫生管理办法》。该《办法》规定:对"以转基因动植物、微生物或者其直 接加工品为原料生产的食品和食品添加剂"必须进行标识。因此建立一套方便、快捷的转基 因产品检测技术是贯彻标识制度的重要前提。
[0003] 转基因玉米NK603品系是由美国孟山都公司(Monsanto Company)研制开发,将耐 除草剂基因CP4 EPSPS导入玉米中,这一基因编码的CP4 EPSPS蛋白,可以使玉米抗草铵 膦。目前该转基因玉米虽已经欧盟正式批准用于食品和饲料,但其安全性仍然备受关注。
[0004] 目前对转基因产品的检测主要是基于核酸水平的PCR检测,包括多重 PCR(Multiplex PCR)、实时定量PCR(Real-time PCR)等,但是这些方法需要具有实时荧光 检测功能的热循环设备,存在操作步骤繁琐,检测时间较长,不适合于现场实时检测以及跟 踪检测。2000年,日本学者Notomi等开发了一种新颖的恒温核酸扩增方法一一环介导等温 扩增技术(l〇〇P _mediated isothermal amplification,LAMP),该方法针对革 E1 基因的 6 个 区域设计4种特异引物,提高了检测的特异性,同时其扩增效率较普通PCR高,很大程度地 提高了灵敏度,LAMP技术具有简单、快速、特异性强等优点,已用于致病菌、病毒、寄生虫、过 敏原、物种鉴定等检测中。
[0005] 随着越来越多的转基因产品大规模商业化生产,转基因组分的快速检测受到广泛 关注,LAMP扩增技术为恒温扩增,可不依赖热循环仪,普通恒温仪器既可以进行检测。因此 快速简便的LAMP已成功应用于转基因大豆、棉花、玉米、水稻等作物的检测。

【发明内容】

[0006] 本发明的目的在于提供一种转基因玉米NK603品系的LAMP检测试剂盒及检测方 法。
[0007] 一种转基因玉米NK603品系的LAMP检测试剂盒,其反应体系中包括:甜菜碱、 dNTP、Bst DNA聚合酶缓冲液、荧光染料SYTO-9、Bst DNA聚合酶、Mg2+、阳性对照、阴性对 照;其特征在于,还包含下述引物,所述引物的碱基序列如下所示:
[0008] 外引物 F3 :5' -GACCAGGTAATCTTACCTTTGT-3 '
[0009] 外引物 B3 :5,-TGAAACCGCTTTCAAGAGAA-3,
[0010] 内引物 FIP :5' -GGCCGCGTTAACAAGCTTACTTTTTGGACTATCCCGACTCTCT-3'
[0011] 内引物 BIP :5,-CTTGGTACCACGCGACACATTTTCTGTTATGGTTCGAGAAGAGAT-3 '
[0012] 环引物 LF :5' -TCGAGGTCATTCATATGCTTGA-3'
[0013] 环引物 LB:5' -AGTGTTTGAGTGGATCCTGTT-3'。
[0014] 优选地,所述的反应体系中甜菜碱浓度为0.3-1. 5mM、dNTP浓度为0.2-3. 5mM、 Mg2+浓度为2-18mM。
[0015] 优选地,所述反应体系中所述的内引物和外引物的浓度之比为1-8 : 1 ;环引物和 外引物浓度之比为1-2 : 1。
[0016] 优选地,所述反应体系含有0. 2 y M外引物、1. 6 y M内引物、0. 4 y M环引物。
[0017] 优选地,Bst DNA聚合酶含量为4-10U,更优选地,Bst DNA聚合酶含量为8U。
[0018] 优选地,其特征在于所述的阳性对照为转基因玉米NK603品系的基因组DNA。
[0019] 优选地,所述的阳性对照为含有NK603品系耐除草剂基因CP4EPSPS基因的重组质 粒。
[0020] 所述的阳性对照重组质粒制备方法如下所述:提取转基因玉米NK603品系基因组 DNA,利用引物F3/B3进行PCR,扩增并回收CP4EPSPS基因并克隆到载体质粒中,转化大肠杆 菌感受态细胞,提取质粒,DNA测序确认序列正确的质粒。
[0021] 本发明还提供了一种应用LAMP检测试剂盒检测转基因玉米NK603品系的检测方 法,包括以下主要步骤:
[0022] (1)提取待检测样品基因组DNA,以样品基因组DNA为模板;
[0023] (2)按照检测样品数目,按照每样品25微升反应体系准备LAMP扩增反应液:取 2XLAMP reaction mixture 12.5 yL,其中包括 40mmol/L Tris-HCl pH 8.8, 20mmol/L KCl,16mmol/L MgS04, 20mmol/L (NH4) 2S04,0. 2 % Tween-20,0. 8mol/L Betaine, 2. 8mmol/L of dNTPs ;加入lOymol/L的外引物F3溶液0? 5yL、10ymol/L的外引物B3溶液0? 5yL ; 加入20 y mol/L的内引物FIP溶液2 y L、20 y mol/L的内引物BIP溶液2 y L ;加入5 y mol/ L的环引物LF溶液2 y L、5 y mol/L的环引物LB溶液2 y L ;加入荧光染料SYTO-9 0. 5 y L、 8U/ y L Bst DNA 聚合酶 1 y L、混匀;
[0024] (3)加入待检测样本DNA模板2 y L,混匀反应体系;
[0025] (4)等温扩增:在PCR管内壁加20 y L密封液;63°C恒温反应45min,反应结束后, 与阳性对照显示荧光相比较;
[0026] (5)结果判读:反应结束后采用实时荧光图来判断扩增结果,反应中使用的染料 为荧光染料SYT0-9。所述的判定结果是根据荧光染料SYT0-9形成的扩增曲线作为检出转 基因玉米品系NK603的结论,反之,结果为未检出转基因玉米品系NK603。
[0027] 本发明提供了一种闭管荧光检测体系,本发明根据LAMP技术原理,将该方法与实 时荧光技术相结合,在LAMP反应体系中,加入荧光染料,扩增结束后,扩增得到的DNA与荧 光染料相结合,不需要电泳,在肉眼或荧光检测仪上即可方便观察扩增结果,该实时荧光 LAMP快速检测方法,适合在基层检测单位及
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