与大豆油脂含量显著关联的GmTPR基因分子标记及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及大豆分子育种，属于大豆遗传育种领域，具体涉及一种与大豆油脂含 量显著关联的GmTPR基因分子标记及其应用。
【背景技术】
[0002] 大豆是最重要的油料作物，大豆油占全球植物油产量的28%，脂肪酸约占大豆种 子质量的20%。脂肪酸在若干疾病的预防和治疗中起重要作用，包括癌症，心脏疾病和近 视。大豆油脂还能作为生物柴油的重要原料。因此，提高大豆种子的油脂含量不仅对人类 健康起重要作用，而且对我国经济和能源问题有重要意义。
[0003] 大豆油脂含量是复杂的数量性状，受多基因控制及环境的影响。目前已有大量关 于大豆油脂含量的QTL定位研宄，但由于定位区间比较大，与油脂含量紧密连锁的分子标 记不多，在育种中已知的能够提高油脂含量的基因十分有限。到现在为止，只报道了少数与 大豆油脂合成相关的重要基因，如：FAD2-lA(Glymal0g42470)及 FAD2-lB(Glyma20g24530) (Pham A T, et al. 2010), DGAT (Vaziri N D, et al. 2004) , LACS (Pulsifer I P, et al. 2012)、MPT1 (Qi Q，et al. 2003)、GmbZIP123 (Song Q X，et al. 2013)和 ACCase (Ralston A W，et al. 1948)。因此挖掘和利用新的与油脂含量显著相关的基因及其分子标记，对准确 筛选、培育高油大豆品种具有重要实践意义。
[0004] 分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异即SNP为基础的遗传标记，是 DNA水平遗传多态性的直接的反映。与其他几种遗传标记一一形态学标记、生物化学标记、 细胞学标记相比，DNA分子标记技术因其具有多态性高、检测方便、快速、准确等特点，在大 豆油脂育种中发挥了极其重要的作用。一方面通过寻找与油脂基因紧密连锁的分子标记， 能够直接或间接地定位油脂基因；另一方面，应用与油脂基因紧密连锁的分子标记，能够把 多个基因聚合在同一个品种中，从而实现基因累加，提高油脂育种的效率；更为重要的是， 应用分子标记能够在基因型水平上对油脂基因进行深入评价和鉴定，为分子标记辅助育种 奠定基础。
[0005] 大豆油脂含量QTL定位中常用的SSR标记一般距离控制油脂的基因距离较远，尚 不能用于分子标记辅助育种。虽然大豆油脂相关基因已有报道，但基于油脂代谢相关基因 开发的功能分子标记非常少。有少数与脂肪酸代谢基因相关的SNP标记（如FAD2基因） 已被用于大豆高油酸的分子育种，但关于大豆高油的分子育种尚缺乏功能分子标记。另外， SNP标记分型一般需要特殊的仪器，难以在常规实验室中分型，限制了其广泛推广到育种单 位。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是为了解决大豆高油育种缺乏与油脂含量紧密连锁的分子标记问 题，故提出了一种与大豆油脂含量显著关联的GmTPR基因分子标记及其应用，该分子标记 不仅与油脂含量显著关联，而且位于GmTPR基因的外显子区，并在不同遗传背景的材料中 验证了其有效性，具有筛选含高、低油脂的大豆和大豆油脂育种中的用途，为标记辅助选育 高油大豆新品种提供了一种有用的分子标记。
[0007] 为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种与大豆油脂含量显著关联的GmTPR 基因分子标记，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No. 1所示序列，在第174位有1个T174-C174 碱基突变，导致SNP-dCAPs多态性。
[0008] 所述功能分子标记的碱基突变位点位于大豆GmTPR基因的外显子区。
[0009] 所述分子标记由SNP标记转换为SNP-dCAPs标记，可以在常规实验室中分型，能广 泛推广到育种单位。
[0010] 具体地说，所述分子标记的获得是通过以下步骤实现的：
[0011] ⑴根据已知油脂相关同源基因分析，选择一个油脂代谢相关基因GmTPR，编码 TPR 蛋白(pentatricopeptide repeat-containing protein，TPR)；
[0012] (2)通过数据库（http://www. soykb. org/)提供的SNP信息查找该候选基因内部 (包括UTR区）的SNP位点，根据数据库中的SNP多态性计算最小等位基因频率MAF，选择 MAF彡10%的SNP位点；
[0013] (3)再根据SNP位点所在区域和突变类型，排除内含子区域和同义突变，同时通过 dCAPS Finder 2.0(http://helix. wustl.edu/dcaps/dcaps.html)分析 SNP 的酶切位点。
[0014] (4)最终在5号染色体上38473970位置发现了 SNP位点，在扩增区域的174位置 发现了酶切位点。
[0015] 本发明还提供了一种用于扩增所述功能分子标记的引物对，其特征在于，所述引 物对的引物1如序列表Seq ID No. 2所示，引物2如序列表Seq ID No. 3所示；
[0016] Seq ID No. 2 :5,-ATGTGGAAGAGGAGGAGAAG-3' ；
[0017] Seq ID No. 3 :5'-TCAAGGGAGGGTACAATTTA-3'。
[0018] 本发明还提供了所述分子标记或引物对在大豆油脂含量分子标记辅助选择中的 应用。
[0019] 本发明进一步提供了一种大豆油脂含量分子标记辅助选择的方法，具体步骤为：
[0020] (1)根据权利要求1所述分子标记设计引物，以被检测大豆基因组DNA为模板进 行 PCR 扩增，扩增程序为 95°C预变性 5min，94°C 40s，53. 5°C 30s，72°C 1. 5min，30 个循环， 72°C延伸 lOmin ;
[0021] (2)PCR产物进行胶回收，回收后分别用限制性内切酶CviJI酶于37°C酶切2h ;
[0022] (3)酶切产物用2. 0%琼脂糖凝胶进行电泳分离后用Bio-Rad凝胶成像系统进行 检测和记录；
[0023] (4)对应扩增产物不可以切开，则SNP位点碱基为T，对应扩增产物可以切开，则 SNP位点碱基为C，碱基为T的大豆品种籽粒油脂含量低，碱基为C的大豆品种油脂含量高。
[0024] 有益效果：
[0025] 1、本发明所公开的SNP-dCAPS分子标记是位于油脂代谢相关基因GmTPR外显子区 的分子标记，不仅与油脂含量显著关联，而且可以追踪大豆油脂相关基因GmTPR的多态性。
[0026] 2、在大豆育种过程中，利用本发明公开的分子标记，可快速鉴定和筛选高油脂和 低油脂的大豆，进行分子标记辅助选择，提高育种效率，加速育种进程。
[0027] 3、本发明公开的SNP-dCAPS分子标记可采用PCR扩增和酶切检测，不需要特殊的 SNP分型仪器，有利于在大多数实验室和大豆育种单位推广。
【附图说明】
[0028] 图1所示为本发明实施例3中GmTPR基因SNP-dCAPS分子标记在不同油脂含量的 大豆品种中的基因型分析的凝胶电泳图。
【具体实施方式】
[0029] 下面结合说明书附图对本发明创造作进一步说明。下述实施方法中的实验方法均 为常规方法，所涉及实验材料均为常规生化试剂。
[0030] 实施例1 :扩增GmTPR基因SNP-dCAPS分子标记的引物对的开发
[0031] 根据分子标记的序列（如序列表Seq ID No. 1所示）在phytozome (http://www. phytozome.net/)中，采用BLAST方法，获得序列一致率等于100%的大豆基因组序列。采 用引物设计软件PRIMER5.0,设计特异扩增含有全部或部分分子标记的序列Seq ID No. 1的 引物对。在phytozome (http://www. phytozome. net/)中，对引物对进行BLAST，检测引物对 在大豆中扩增的产物唯一，即为所示分子标记序列。
[0032] 利用premier 5. 0软件在SNP位点上下游设计引物：
[0033] (1)引物的长度一般为15_30bp ;
[0034] (2)引物序列在模板内有较高的相似性，尤其是3'端，否则容易导致错配；
[0035] (3)引物3'端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响，不同的末位碱 基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此 应当避免在引物的3'端使用碱基A ;引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败；
[0036](4)引物序列的GC含量一般为40-60 %，过高或过低都不利于引发反应，上下游引 物的GC含量不能相差太大。
[0037] (5)引物所对应模板位置序列的Tm值在72°C左右