田鼠巴贝虫Bm7重组抗原蛋白及其制备方法和用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子、细胞生物学研宄领域，具体涉及田鼠巴贝虫未命名蛋白（Bm7) 的重组抗原蛋白及其制备方法。此外，本发明还涉及该田鼠巴贝虫Bm7重组抗原蛋白在制 备检测田鼠巴贝虫病人血清抗体的试剂或试剂盒中的应用。
【背景技术】
[0002] 巴贝虫（Babesia)是寄生于人或其它哺乳动物红细胞内一重要蜱媒原虫，可引起 人兽共患巴贝虫病（zoonotics babesiosis)，在亚、欧、美、非洲等均有分布。巴贝虫具机会 致病性，对免疫功能低下者致病性增强，对免疫功能缺陷者甚可危及生命。巴贝虫病作为一 人兽共患蜱媒寄生虫病在我国研宄主要在畜牧兽医学领域，动物感染率较高而在人体感染 巴贝虫研宄较少，相关研宄基础薄弱，而近年来随着人口老龄化速度加快、HIV (人类免疫缺 陷病毒，全称为human immunodeficiency virus)感染等导致免疫功能低下人群增加，巴贝 虫作为一重要机会致病原虫在HIV病人等免疫功能缺陷者中感染病例屡见报道，并严重威 胁病人生命；另人们活动范围的扩大，进入人兽共患病原体自然疫源地等，人群寄生虫感染 谱不断发生变化，时有巴贝虫病感染重症病例报道。在我国，巴贝虫病属于新发寄生虫病， 最近几年时有人体感染病例报道，目前巴贝虫病流行与防治工作存在以下特点：
[0003] (1)高危地区分布广泛：近年来包括我国大陆和台湾地区在内的亚洲地区陆 续有人体感染巴贝虫病例报道，主要以田鼠巴贝虫样（B. microti-like)巴贝虫为主， Saito-Ito等曾对我国浙江、福建等地，Sun等对中国黑龙江地区及Zamoto等对包括中国新 疆维吾尔自治区在内的欧亚大陆东北地区进行蜱媒和/或宿主B. microti感染情况调查表 明以上地区均有包括感染巴贝虫在内的蜱传病原体及其自然疫源性宿主存在。虽巴贝虫自 然疫源地在全国广泛分布且时有病例报道，但对这些高危地区巴贝虫病人群感染与带虫者 情况尚不清楚。
[0004] (2)巴贝虫感染隐匿性普遍：巴贝虫具机会致病性，人群感染巴贝虫可由健康携 带无症状到巴贝虫感染免疫功能缺陷如HIV感染病人或低下出现明显的临床症状，甚至死 亡，许多无症状带虫者检测是通过献血或者器官将病原体传播给免疫功能低下的血液或者 器官受体而导致巴贝虫病，故巴贝虫感染在健康人群中具隐匿性，威胁血制品的安全。且目 前我国对隐性感染巴贝虫的血液供体尚无筛查标准与工具，迫切需要敏感性与特异性较高 的筛查方法以确保输血及其相关血制品的安全。
[0005] (3)巴贝虫形态学诊断困难：巴贝虫裂殖子尤其是B. microti与恶性疟原虫 (Plasmodium falciparum)环状体寄生红细胞期形态相似。在部分疱疾高发地区，疱疾患 者合并感染巴贝虫及巴贝虫病患者可被误诊为疟疾或漏诊而被忽视。在我国云南等地蜱媒 与保虫宿主野鼠中B. microti调查研宄发现其自然疫源地同时也是疟疾流行地区，该地区 具有疟疾样发热病人人群中已检出巴贝虫感染病例，这些病例可能合并感染疟原虫而被忽 视。疟原虫与巴贝虫在形态学上很难区分，分子生物学诊断受到现场工作的限制，亟需开展 相关诊断与鉴别诊断技术研宄。
[0006] 免疫学的诊断方法具有操作简便、敏感性较高、特异性较好和流行区群众的依从 性较高等优点在相关疾病大规模筛查、血清流行病学调查以及防治效果的评价等方面起到 了极为重要的作用。国内外巴贝虫病研宄现状分析表明，现有巴贝虫病诊断技术相当落后， 可供血清学快速诊断抗原较少，且人体产生的抗体水平滞后于原虫血症，导致不同的诊断 方法灵敏性、特异性均不能满足实际需求。
[0007] 目前，巴贝虫病免疫诊断最常用的抗原是虫体粗抗原，但虫体抗原成分复杂，制备 步骤繁琐，来源有限且不易质控，难以适应大规模现场疾病普查的需求。依靠基因工程方法 生产的重组抗原分子可为现场推广应用提供大量的抗原材料，且成分明确、特异性好。
[0008] 田鼠巴贝虫Bm7 -未知功能蛋白，是巴贝虫新的蛋白序列。本发明通过PCR扩增 出田鼠巴贝虫Bm7全基因，并在大肠杆菌中重组表达此基因，得到大小约为24kDa的重组 蛋白，经ELISA试验确认所得重组蛋白用于田鼠巴贝虫病的诊断具有较高的敏感性和特异 性，是潜在的诊断抗原候选靶标，从而完成了本发明。
[0009] 在本发明之前，还没有出现涉及本发明田鼠巴贝虫Bm7重组抗原蛋白及其用于巴 贝虫病诊断的公开报道。
【发明内容】
[0010] 本发明要解决的技术问题之一是提供一种田鼠巴贝虫Bm7重组抗原蛋白。
[0011] 本发明要解决的技术问题之二是提供一对用于田鼠巴贝虫Bm7基因PCR扩增的特 异性引物。
[0012] 本发明要解决的技术问题之三是提供该田鼠巴贝虫Bm7重组抗原蛋白的制备方 法。
[0013] 本发明要解决的技术问题之四是提供该田鼠巴贝虫Bm7重组抗原蛋白在制备检 测巴贝虫病患者血清抗体的试剂或试剂盒中的应用。
[0014] 本发明通过生物信息学技术分析获得了田鼠巴贝虫Bm7的编码基因序列（如SEQ ID NO. 1所示序列，Genbank CCF73510. 1)。利用分子生物学技术对田鼠巴贝虫Bm7基因进行 PCR扩增，纯化扩增产物，将所得产物、质粒载体pET-28a (+)分别进行酶切、回收，连接构建 成Bm7基因原核表达的重组质粒pET-28a (+) -Bm7,通过转化筛选，抽提重组质粒，经PCR、测 序及酶切鉴定确认后，转化至宿主细胞大肠肝菌中表达；取表达量较高的克隆，发酵制备菌 体，鉴定重组蛋白的溶解性；由于表达的重组蛋白为包涵且难溶于变性剂中，因此直接将全 菌体进行SDS-PAGE，经卡马斯亮蓝染色后切下目的条带，用PAGE胶蛋白微量回收试剂盒回 收纯化目的蛋白，最终得到纯化的重组蛋白Bm7,完成了 Bm7基因的体外克隆表达及纯化。
[0015] 为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：
[0016] 本发明第一个方面是提供一种田鼠巴贝虫Bm7重组抗原蛋白，其具有SEQ ID NO. 2 所示氨基酸序列的蛋白、或由该蛋白发生一个或多个氨基酸的置换、缺失或插入而形成的 具有相同功能的蛋白；该田鼠巴贝虫Bm7重组抗原蛋白采用如下方法制备：
[0017] 1)田鼠巴贝虫Bm7基因序列的扩增：设计SEQ ID N0:3所示的核苷酸序列或其互 补链和SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列或其互补链为引物，以含田鼠巴贝虫cDNA为模板进 行PCR扩增；所得PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，并回收纯化；
[0018] 2)田鼠巴贝虫Bm7重组质粒的构建和鉴定；
[0019] 3)将该重组质粒转化于宿主细胞中，并在宿主细胞中表达，得到表达的重组蛋 白；
[0020] 4)PAGE胶蛋白微量回收试剂盒回收纯化表达的重组蛋白。
[0021] 本发明第二个方面是提供了一对用于田鼠巴贝虫Bm7基因PCR扩增的特异性引 物，其序列为：
[0022] 上游：5' -CCGGAAITC ATGCATATCAACTACAAAITAAITATA-3'（如 SEQ ID NO:3 所示） 或其互补链；
[0023]下游：5'-CCGCTCGAG TTAAGCAGCATTAGGTGTG-3'（如 SEQID N0:4所示）或其互补 链。
[0024] 本发明第三个方面提供了一种田鼠巴贝虫Bm7重组抗原蛋白的制备方法，包括如 下步骤：
[0025] 1)田鼠巴贝虫Bm7基因序列的扩增（用PCR技术从田鼠巴贝虫cDNA中获得Bm7 的DNA片段）；
[0026] 2)田鼠巴贝虫Bm7重组质粒的构建和鉴定：用pET-28a(+)载体构建田鼠巴贝虫 Bm7重组表达质粒pET-28a(+)-Bm7 ;
[0027] 3)将pET-28a(+)_Bm7重组质粒转化于宿主细胞中，并在宿主细胞中表达，得到表 达的重组蛋白Bm7 ;
[0028] 4) PAGE胶蛋白微量回收试剂盒回收纯化表达的田鼠巴贝虫Bm7重组蛋白。
[0029] 步骤1)田鼠巴贝虫Bm7基因序列的扩增，具体为：
[0030] 以含有田鼠巴贝虫Bm7基因序列的cDNA克隆为模板，SEQ ID NO. 3 (CCGGAATTC ATGCATATCAACTACAAATTAATTATA)或其互补链为 5' 引物，SEQ ID NO. 4(CCGCTCGAG TTAAGCAGCATTAGGTGTG)或其互补链为3'引物，进行PCR扩增，所得PCR产物经琼脂糖凝胶 电泳，用QIAquick'&胶回收试剂盒（QIAquick? Gel Extraction Kit)回收纯化。所述PCR 扩增的反应条件为95°C预变性5min ;94°C变性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸lmin，72°C 延伸10min，30个循环；最后保存于4°C。
[0031] 步骤2)构建可在宿主细胞中表达田鼠巴贝虫Bm7编码基因的重组质粒 pET-28a(+)-Bm7,具体为：
[0032] 将纯化的田鼠巴贝虫Bm7基因PCR产物片段和质粒载体pET-28a (+)分别用 限制性内切酶EcoR I和Xho I进行酶切，用QIAquic?胶回收试剂盒（QIAquick8' Ge 1 Extraction Kit)回收纯化。纯化后的目的基因片段和载体酶切片段按照3:1(摩尔比）的 比例进行连接，构建成Bm7编码基因原核表