β淀粉样蛋白的人源化抗体的制作方法

β淀粉样蛋白的人源化抗体的制作方法
【专利说明】(3淀粉样蛋白的人源化抗体
[0001] 本申请是申请日为2008年6月12日的、发明名称为淀粉样蛋白的人源化抗 体"的中国专利申请200880103155. 0(PCT/US2008/007318)的分案申请。
[0002] 相关专利申请的交叉引用
[0003] 本申请要求2007年6月12日提交的美国临时申请系列号No.60/943, 509的优先 权，其并入本文作为参考。
[0004] 发明背景
[0005] 本发明涉及用于淀粉样变性（一组与淀粉样蛋白相关的紊乱和异常，如阿尔茨海 默病）诊断和治疗的方法和组合物。
[0006] 淀粉样变性不是单一的疾病实体，而是一广类以蜡质淀粉状蛋白（称为淀粉样蛋 白，其在一种或多种器官或身体系统中积累）的细胞外组织沉积为特征的进行性疾病过 程。随着淀粉样蛋白沉积物的积累，其开始干扰器官或身体系统的正常功能。有至少15种 不同类型的淀粉样变性。主要形式是没有已知前因的原发性淀粉样变性，出现在一些其它 病症之后的继发性淀粉样变性，和遗传性淀粉样变性。
[0007] 继发性淀粉样变性发生在慢性感染或炎性疾病，如结核病、称为家族性地中海热 的细菌感染、骨感染（骨髓炎）、类风湿性关节炎、小肠炎症（肉芽肿性回肠炎）、霍奇金病 和麻风病期间。
[0008] 淀粉样蛋白沉积物包括淀粉样蛋白P(五边形）成分（AP)-一一种与正常血清淀 粉样蛋白P(SAP)相关的糖蛋白，和硫酸盐化的糖胺聚糖（GAG)-一结缔组织的复杂糖。淀 粉样蛋白原纤维（fibril)约占淀粉样蛋白物质的90%，包含数种不同类型的蛋白质中的 一种。这些蛋白质能够折叠成所谓的折叠"片状原纤维，这种独特的蛋白质构型呈现 出对刚果红（Congo red)的结合位点，导致了淀粉样蛋白的独特的着色性质。
[0009] 许多老年病基于淀粉样蛋白样蛋白（amyloid-like proteins)或与其相关，并且 部分地以促进疾病发生和疾病发展的淀粉样蛋白或淀粉样蛋白样物质的细胞外沉积物的 聚集为特征。这些疾病包括但不限于神经紊乱，如阿尔茨海默病（AD)、路易体痴呆（Lewy body dementia)、唐氏综合征（Down's syndrome)、遗传性脑出血伴淀粉样变性（荷兰型）； 关岛帕金森-痴呆综合征。其它基于淀粉样蛋白样蛋白或与其相关的疾病有进行性核上性 麻痹、多发性硬化；克-雅二氏病（Creutzfeld Jacob disease)、帕金森氏病、HIV相关痴 呆、ALS(肌萎缩性侧索硬化症）、成年发病型糖尿病；老年性心脏淀粉样变性；内分泌肿瘤 以及其它疾病，包括黄斑变性。
[0010] 尽管这些疾病的发病机理可能是不同的，但它们的特征性沉积物经常含有许多共 同的分子成分。在显著程度上，这可能归因于促炎通路的局部激活，从而导致激活的补体成 分、急性期反应物、免疫调节剂及其它炎性介质的同时沉积（McGeer等人，1994)。
[0011] 阿尔茨海默病（AD)是一种神经紊乱，其被认为主要是由淀粉样蛋白斑块，即蛋白 质异常沉积物在脑中的积累，引起的。在患病个体脑中发现的最常见的淀粉样蛋白的类型 主要包含Af3原纤维。科学证据表明0淀粉样蛋白在斑块中的产生和累积的增加导致神经 细胞死亡，这助长了 AD的发展和进程。在关键脑区域中神经细胞的损失进而又导致神经递 质的减少和记忆的减损。主要负责斑块增大的蛋白质包括淀粉样蛋白前体蛋白（APP)和两 种早老蛋白（早老蛋白I和早老蛋白II)。通过酶0和Y分泌酶相继切割淀粉样蛋白前 体蛋白（APP)(其在大多数细胞中组成型表达和代谢）导致39至43个氨基酸的Af3肽的 释放。APP的降解很可能增加其在斑块中聚集的倾向。特别是Af3 (1-42)片段由于其C-末 端的两个极为疏水的氨基酸残基，具有构建聚集物的高倾向。因此认为A 0 (1-42)片段主 要参与并造成AD中神经炎斑块形成的起始，并因此具有高病理学潜力。因此需要能阻止淀 粉样蛋白斑块形成以及在AD中散开已有的淀粉样蛋白斑块的药剂。
[0012] AD的症状缓慢显现，第一个症状可能仅仅是轻度健忘。在此阶段，个体可能忘记新 近的事件、活动、熟悉的人或事的名称以及不能解决简单的数学问题。随着疾病进展，症状 更易于被察觉并且变得足够严重从而导致患有AD的人们或他们的家人寻求医学帮助。AD 的中期症状包括忘记如何做诸如整理清洁的简单任务，并且出现说话、理解、阅读或书写方 面的问题。后期的AD患者可能变得焦虑或具攻击性，可能从家里走失以及最终需要全面护 理。
[0013] 目前，唯一的明确诊断AD的方法是在个体死亡后的尸体解剖中鉴别脑组织中的 斑块和缠结。因此，当人仍活着的时候，医生只能作出"可能"或"很可能"患有AD的诊断。 应用目前的方法，内科医师利用数种诊断"可能"AD的工具，至多可以在90%的时间正确诊 断AD。内科医师询问个体的一般健康状况、过往的医疗问题、以及在完成日常活动时出现任 何困难的历史。关于记忆、解决问题、注意力、计算和语言的行为测试提供认知减退的有关 信息，而医疗检验诸如血、尿或脊髓液的检验和脑部扫描可以提供一些其它信息。
[0014] AD的管理由基于药物的和基于非药物的治疗组成。以改变疾病潜在的过程（延缓 或逆转进程）为目的的治疗迄今在很大程度上是不成功的。修补神经细胞的化学信使（神 经递质）不足（缺陷）或功能障碍的药物，特别是胆碱酯酶抑制剂（ChEI)(如他克林和卡 巴拉汀（rivastigmine))已显示出可改善症状。ChEI阻碍神经递质的酶促降解，由此增加 脑中可用于传递神经信号的化学信使的量。
[0015] 对于处于疾病早期和中期阶段的一些人，药物他克林 (tacrine,COGNEX?, Morris Plains，NJ)、多奈哌齐（ARICEPT?, Tokyo, JP)、卡巴拉汀（rivastigmine,EXELON?, East Hanover, NJ)或加兰他敏 (galantamine,REMINYL?, New Brunswick, NJ)可以在有限的时间内帮助防止某些症 状变得更严重。另一种药物美金刚（memantine,NAMENDA?, New York, NY)已被核准 治疗中度至重度的AD。也有药物用于对付AD的精神病学表现。还有一些药物可以帮助控 制AD的行为症状，如失眠、兴奋、恍惚、焦虑和抑郁。治疗这些症状通常使患者更加舒服，并 使护理人员更易于进行护理。不幸的是，尽管有显著的治疗进展显示出这类药剂可靠地优 于安慰剂，但是疾病仍继续发展，并且对精神功能的平均作用仅为有限的。很多用于AD药 物治疗的药物（例如ChEI)也具有副作用，包括胃肠功能失调、肝脏毒性和体重减轻。
[0016] 另外一种基于淀粉样蛋白样蛋白的聚集和沉积或与其相关的疾病是黄斑变性。
[0017]黄斑变性是引起视网膜中心区域，即黄斑（在眼睛后部的像纸一样薄的组织，感 光细胞在此传送视觉信号至大脑）变性的常见眼病。通过黄斑区处理产生锐利、明晰、"正 向"的视像。损伤黄斑区导致盲点的产生和视像的模糊或变形。老年性黄斑变性（AMD)在 美国是引起视力损伤的主要原因，并且对于65岁以上的人来说，其为高加索人中法定失明 的主要原因。大约有180万40岁及以上的美国人患有晚期AMD，而其它730万患有中等AMD 的人具有视力丧失的真实风险。政府估计到2020年，将会有290万人患有晚期AMD。AMD 受害者常常惊讶和沮丧地发现对这种失明病症的原因和治疗的了解是如此之少。
[0018] 存在两种形式的黄斑变性：干性黄斑变性和湿性黄斑变性。有百分之八十五的黄 斑变性病例诊断为干性形式，其中黄斑区的细胞缓慢地开始损坏。两只眼睛通常都受到干 性AMD的影响，但一只眼睛可能丧失视力而另外一只眼睛可能保持不受影响。视网膜下的 黄色沉积物，即脉络膜小疣（drusen)，是干性AMD的早期征兆。随着脉络膜小疣的数目或大 小的增加，发展成晚期干性AMD或湿性AMD的风险也增加。干性AMD可能在不转变为湿性 形式疾病的情况下进一步发展并导致视力丧失；然而，早期的干性AMD也有可能突然变为 湿性形式。
[0019] 湿性形式尽管只占病例的百分之十五，却导致了百分之九十的失明，并且被视为 晚期AMD(没有早期或中期阶段的湿性AMD)。湿性AMD总是处于干性形式的疾病之后。当 干性形式恶化时，一些人在黄斑区的后面开始有异常的血管生长。这些血管非常脆弱并且 会泄漏液体和血液（因此是"湿性"黄斑变性），导致对黄斑区的快速损伤。
[0020] 干性形式的AMD最初往往会引起轻度的视力模糊。然后，特别是视力的中心可能 变得模糊不清，并且这一区域随着疾病的发展将变大。如果只有一只眼睛受到影响，则可能 注意不到症状。在湿性AMD中，直线可能看起来像波浪状，并且可迅速发生中心视力的丧 失。
[0021] 黄斑变性的诊断一般涉及扩张眼检查、视敏度检查，以及用称为眼底检查的方法 查看眼睛的后部以帮助诊断AMD，并且如果有湿性AMD的嫌疑，则也可能进行荧光素血管造 影术。如果干性AMD达到晚期阶段，没有现行治疗能预防视力丧失。然而，抗氧化剂和锌的 特定高剂量配方可以延缓或预防中期AMD发展至晚期阶段。Macugen? (哌加他尼钠注 射液）、激光光凝术和光动力学治疗能够控制黄斑区中的异常血管生长和流血，这对有些患 有湿性AMD的患者有用；然而，视力已经丧失的则不能通过这些技术恢复。如果视力已经丧 失，存在可以帮助提高生活质量的低视力辅助器。
[0022] 年龄相关性黄斑变性（AMD)的最早征兆之一是称为脉络膜小疣的细胞外沉 积物在视网膜色素上皮（RPE)基底层和布鲁赫膜（BM)之间的积累。近来由Anderson 等人进行的研宄已证实脉络膜小琉包含淀粉样蛋白0 (Experimental Eye Research 78(2004)243-256)。
[0023] 正在进行的研宄继续探索可能促进AMD的环境、遗传和饮食因素。也正在探索新 的治疗策略，包括视网膜细胞移植物、能够预防或减缓疾病发展的药物、放射疗法、基因疗 法、植入到视网膜的可帮助刺激视力的计算机芯片、以及预防黄斑区下新血管生长的药剂。
[0024] 开发新药物时，考虑的一个重要因素是对目标患者来说使用的容易性。由于对患 者的便利性，口服药物递送（特别是片剂、胶囊剂和软胶剂）占所有消费剂型的70%。药物 开发人员认同患者更喜欢口服递药，而不是接受注射或其它更具侵入性的药物给药方式。 导致减少给药间隔频率（即一天一次或持续释放）的制剂也是优选的。以口服剂型给药抗 生素的容易性导致了治疗期间患者顺从性的增加。
[0025] 需要有效的方法和组合物用于预防或解决淀粉样变性相关并发症一一一组与淀 粉样蛋白斑块的形成相关的疾病和紊乱，包括继发性淀粉样变性和年龄相关性淀粉样变 性，包括但不限于神经紊乱如阿尔茨海默病（AD)、路易体痴呆、唐氏综合征、遗传性脑出血 伴淀粉样变性（荷兰型）；关岛帕金森-痴呆综合征；以及其它基于淀粉样蛋白样蛋白或与 其相关的疾病，如进行性核上性麻痹、多发性硬化；克-雅二氏病、帕金森氏病、HIV-相关痴 呆、ALS(肌萎缩性侧索硬化症）、成年发病型糖尿病；老年性心脏淀粉样变性；内分泌肿瘤， 以及其它疾病，包括黄斑变性。特别需要能对抗疾病的生理学表现（如与淀粉样蛋白或淀 粉样蛋白样肽的纤维聚集相关的斑块形成）的药剂。
[0026] 据报道，由接种与弗氏完全或不完全佐剂混合的^:_42所引起的抗淀粉样蛋白 抗体能够减少人阿尔茨海默病转基因小鼠的淀粉样蛋白的负荷（Schenk等人，1999)。对 NORBA转基因小鼠腹膜内接种在脂质体中重构的四棕榈酰化Ah%引起了显著的抗淀粉 样蛋白抗体滴度，据报道这能够在体外和体内溶解淀粉样蛋白纤维和斑块（Nicolau等 人，2002)。
[0027] Bard等人（2000)首先提出了淀粉样蛋白斑块和纤维溶解的一种可能机制，他们 的结论是，抗体调理斑块，随后小神经胶质的巨噬细胞将之破坏。De Mattos等人（2001)指 出抗0淀粉样蛋白中心结构域的mAb能够结合并完全隔离血浆淀粉样蛋白。他们认为循 环系统中这些mAb的存在改变了脑和血浆中的Af3平衡，有利于外周的清除和代谢而不是 在脑内沉积。
[0028] 用啮齿类动物抗体进行长期人治疗可导致抗球蛋白反应，该反应在给药后约8-12 天可检测到，并在约20-30天达到峰值。如果遭遇了该抗球蛋白反应，必须在不超过约10 天之后中断治疗，并且通常无法在之后的时间重新治疗，因为这将导致继发性抗球蛋白反 应的快速出现。尽管啮齿类动物抗体与人抗体享有相当大程度的序列保守性，但是在啮齿 类动物抗体和人抗体之间存在许多序列差异，其足以使啮齿类动物抗体在人体中成为免疫 原性的。
[0029] 可以通过直接在人体中产生抗体或通过创造"人源化"（又称"重构（reshaped) " 抗体）来解决这一问题。人源化抗体具有这样的可变区氨基酸序列：其含有散布在人或人 样构架序列中的啮齿类动物衍生的CDR。由于人源化抗体的特异性是由啮齿类动物衍生的 CDR提供的，因此其残基应基本上不经改变地应用，仅允许不会显著干扰抗体对其靶抗原的 亲和性和特异性的微小修饰。构架残基可以衍生自任何灵长类动物，或尤其是衍生自任何 人可变区，或其组合，并且所得到的设计好的可变区视为是经重构的。
[0030] 为最大可能地在重构抗体中保留亲和力，适当地选择构架区很重要。已知构架序 列支撑CDR，使之以正确的空间取向与抗原相互作用，并且构架残基有时甚至会参与抗原结 合。为保留抗体对其抗原的亲和性，最好选择与啮齿类动物构架序列最为相似的人构架序 列。然后仍然可能需要用啮齿类构架中相应的残基替换人构架序列中的一个或多个氨基 酸，以避免亲和性的丧失。通过计算机建模可辅助这一替换。
[0031] 本发明提供包括高特异性和高效抗体、尤其是嵌合抗体（包括其片段）、更尤其是 部分或完全人源化的抗体（包括其片段）的新方法和组合物，所述抗体具有特异性识别并 结合一系列0淀粉样蛋白抗原的特定表位的能力，其中所述抗原可以以单体、二聚体、三 聚体等多聚体形式、以聚集体、纤维、纤丝的形式、或以浓缩的斑块形式递呈给抗体。通过 本发明教导提供的抗体特别可用于治疗淀粉样变性：一组与淀粉样蛋白斑块的形成相关的 疾病和紊乱，包括继发性淀粉样变性和年龄相关性淀粉样变性，包括但不限于神经紊乱，如 阿尔茨海默病（AD)、路易体痴呆、唐氏综合征、遗传性脑出血伴淀粉样变性（荷兰型）、关岛 帕金森_痴呆综合征；以及其它基于淀粉样蛋白样蛋白或与其相关的疾病，如进行性核上 性麻痹、多发性硬化；克-雅二氏病、遗传性脑出血伴淀粉样变性（荷兰型）、帕金森氏病、 HIV-相关痴呆、ALS(肌萎缩性侧索硬化症）、成年发病型糖尿病；老年性心脏淀粉样变性； 内分泌肿瘤，以及其它疾病，包括黄斑变性；这些仅仅是其中的一些例子。
[0032] 发明概述
[0033] 在一个实施方案中，本发明涉及嵌合抗体或其片段、或人源化抗体或其片段，其识 别并结合0淀粉样蛋白上的至少一个独特的结合位点，特别是至少两个独特的结合位点， 以及更特别是至少三个独特的结合位点，其中所述的一个、所述的至少两个和所述的至少 三个结合位点各含有主要参与抗体结合的至少一个或两个连续的氨基酸残基。
[0034] 特别地，根据本发明的嵌合抗体或其片段或者人源化抗体或其片段结合0淀粉 样蛋白上的至少两个、特别是至少三个独特的结合位点，其中三个独特结合位点中的至少 两个位点包含至少两个连续的主要参与抗体结合的氨基酸残基，并且三个独特结合位点中 的至少一个位点包含至少一个氨基酸残基。
[0035] 所述包含至少两个连续的主要参与抗体结合的氨基酸残基的至少两个独特结合 位点，在抗原上彼此紧邻，被不参与抗体结合或参与程度与所述至少两个连续的氨基残基 相比显著更小的至少一个氨基酸残基所隔开和/或侧接，从而形成构象不连续的表位。
[0036] 所述分别包含至少两个连续的主要参与抗体结合的氨基酸残基或至少一个主要 参与抗体结合的氨基酸残基的至少三个独特的结合位点，在表位上彼此紧邻，被不参与抗 体结合或参与程度与所述主要参与抗体结合的氨基残基相比显著更小的至少一个氨基酸 残基所隔开和/或侧接，从而形成构象不连续的表位。
[0037] 特别地，提供了嵌合抗体或其片段、或人源化抗体或其片段，其识别并结合0淀 粉样蛋白上的至少一个独特的结合位点，特别是至少两个独特的结合位点，更特别的是至 少三个独特的结合位点，其中所述至少一个或所述至少两个独特的结合位点各含至少两个 连续的主要参与抗体结合的氨基酸残基，其中代表第一结合位点的所述至少两个连续的氨 基酸残基是嵌入在如下核心序列（SEQ IDNO:9)中的-Phe-Phe-:
[0038] Xaa3-Phe-Phe_Xaa4-Xaa5-Xaa 6,其中
[0039] Xaa3是选自Ala、Val、Leu、正亮氨酸、Met、Phe和lie的氨基酸残基；
[0040] Xaa4是选自Ala、Val、Leu、Ser和lie的氨基酸残基；
[0041] Xaa5是选自Glu和Asp的氨基酸残基；
[0042] Xaa6是选自Glu和Asp的氨基酸残基；并且其中所述的氨基酸残基Xaa 3、Xaa4、Xaa5 和Xaa6不参与抗体结合或参与程度显著地小于该-Phe-Phe-结合位点。
[0043] 在本发明的另一个实施方案中，提供了嵌合抗体或其片段、或人源化抗体或其片 段，其中
[0044] Xaa3是 Val 或 Leu，但特别是 Val ;
[0045] 乂884是 Ala 或 Val，但特别是 Ala ;
[0046] 乂385是 Glu 或 Asp，但特别是 Glu ;
[0047] 乂886是 Glu 或 Asp，但特别是 Asp。
[0048] 特别地，提供了嵌合抗体或其片段、或人源化抗体或其片段，其识别并结合0淀 粉样蛋白上的至少一个独特的结合位点，特别是至少两个独特的结合位点，更特别的是至 少三个独特的结合位点，其中所述独特结合位点分别包含至少一个或至少两个连续的主要 参与抗体结合的氨基酸残基，其中代表第一结合位点的所述至少两个连续的氨基酸残基是 嵌入在如下核心序列中的-Phe-Phe-，并且所述至少一个氨基酸残基是嵌入在该核心序列 中的-His-:
[0049] _Xaa「Hi s_Xaa3_Xaa4_Xaa5_Xaa6_Phe_Phe_Xaa7_Xaa8_Xaa9_,
[0050] 其中
[0051] Xaai是选自His、Asn、Gln、Lys和Arg的氨基酸残基；
[0052] Xaa3是选自Asn和Gin的氨基酸残基；
[0053] Xaa4是选自His、Asn、Gln、Lys和Arg的氨基酸残基；
[0054] Xaa5是选自Ala、Val、Leu、Ser和lie的氨基酸残基；
[0055] Xaa6是选自八1&、'\^11、1^11、正亮氨酸、]^1:、？116和116的氨基酸残基；
[0056] Xaa7是选自Ala、Val、Leu和lie的氨基酸残基；
[0057] Xaa8是选自Glu和Asp的氨基酸残基；
[0058] Xaa9是选自Glu和Asp的氨基酸残基；且其中所述的氨基酸残基Xaa p Xaa3、Xaa6、Xaa7、XaajP Xaa 9不参与抗体结合或参与程度分别地小于至显著地小于 该-His-和-Phe-Phe-结合位点。
[0059] 在本发明的另一个实施方案中，提供了嵌合抗体或其片段、或人源化抗体或其片 段，其中
[0060] 父383是Gin或Asn，但特别是Gin ;
[0061] Xaa4是 Lys ;
[0062] Xaa^ Leu ;
[0063] Xaa6是 Val 或 Leu，但特别是 Val ;
[0064] 乂337是 Ala 或 Val，但特别是 Ala ;
[0065] 乂388是Glu或Asp，但特别是Glu ;且
[0066] 乂389是 Asp 或 Glu，但特别是 Asp。
[0067] 在本发明的另一个实施方案中，提供了嵌合抗体或其片段、或人源化抗体或其片 段，其识别并结合0淀粉样蛋白上的至少一个独特的结合位点，特别地至少两个独特的结 合位点，更特别地至少三个独特的结合位点，其中所述至少一个或所述至少两个独特的结 合位点各含至少两个连续的主要参与抗体结合的氨基酸残基，其中代表第二结合位点的该 至少两个连续的氨基酸残基是嵌入在如下核心序列（SEQ ID N0:10)中的-Lys-Leu-:
[0068] XaafXaa^Lys-Leu-Xaas，其中
[0069] Xaai是选自His、Asn、Gin、Lys和Arg的氨基酸残基；
[0070] Xaa2是选自Asn和Gin的氨基酸残基；
[0071] Xaa3是选自Ala、Val、Leu、正亮氨酸、Met、Phe和lie的氨基酸残基；且其中所述 的氨基酸残基Xaa 2、Xaa3不参与抗体结合或参与程度小