明亮发光杆菌冻干粉及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及明亮发光杆菌制剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 基于现阶段我国环境污染状况，发光菌毒性检测法是高效便捷的测定污染物生物 毒性的有效手段。发光菌毒性检测法的最大优势是它可以现场检测，方法快速、准确，操作 简便。发光细菌的相对发光度和水体综合毒性呈显著负相关，利用光电检测技术将对环境 敏感的发光细菌用于水体毒性的检测具有简单、快速的优点。在现场进行毒性检测，要求操 作快速、简单，而新鲜菌液不方便携带，在户外也不易保存。因而更多的是使用冻干粉，只需 5分钟的快速复苏后即可使用，活性与灵敏度与新鲜菌液接近。然而，市场上销售的冻干粉 价格贵，而且难以保证每批活性在同一水平。因此，许多科研机构开始自主研制冻干粉，既 能保证菌的稳定活性也能降低经费。而制备冻干粉的关键在于冻干前的菌悬液制备，其中 保护剂成分及配比影响最显著。本研宄拟通过优化后的菌液制备冻干粉，克服传统检测方 法范围小、结果不稳定等缺点，使得发光菌生物毒性检测范围更广、结果重复性和准确性更 高，为进一步拓宽发光菌在线监测的实际应用打下基础。
[0003]发光杆菌属菌体多呈杆形，革兰氏阴性菌，无孢子和荚膜，有鞭毛。最适生长温度 一般为15-26°C，最适pH范围一般为6.5~7. 5,超过25°C生长.将受到抑制，其.生长.基 质里需要一定的NaCl，起到维持渗透压的作用。
[0004]目前，所述明亮发光杆菌是采用如下的方法保存的：
[0005]取一支发光细菌冻干粉，用砂轮将安瓿瓶切开一个小口，在超净工作台内，缓慢加 入lml冷藏过的3 % NaCl，轻微震荡，复苏lOmin后，用接种环接种至固体培养基中，20°C下 生长20~24小时，直置黑暗处可见蓝绿色光。用接种环挑取一个较亮的单菌落，置于50ml 的液体培养基中，20°C振荡培养18~20小时。
[0006]菌种保存：将菌液离心，除去上清液，重新悬浮于含有3% NaCl的灭菌甘油里 (20%甘油），分装置EP管中，于-70°C保存。此保存方法保存时间较短，仅用于保存菌种， 无法直接进行毒性测试。
[0007] 微生物在进行冻干是一种较好的方法，一般需要有冷冻保护介质（例如简单的 10%脱脂乳或是较复杂的动物血清）帮助菌体在低温下存活。优质的冷冻保护剂至少具备 两种功能：当细胞里的水分逐渐流失时，保护剂可以稳定细胞形态；维持干燥前后的样品 形状。
[0008]目前，常用的冻干保护剂有二糖，如海藻糖、BSA血清，脱脂乳，甘露醇等，但是，单 一的保护剂，难以获得较好的效果，需要进行改进。
[0009] 保护剂的主要作用是在冷冻过程中，消除细胞内部冻结水之间的冰晶机械作用， 因为机械作用会破会细胞内部的化学键、细胞质膜。但由于各个保护剂的浓度、细胞渗透的 能力等等不尽相同，因而所起的冷冻保护作用会有差异。
【发明内容】
[0010] 本发明的目的是提供一种明亮发光杆菌冻干粉及其制备方法，以克服现有技术存 在的缺陷。
[0011] 本发明所述的明亮发光杆菌冻干粉，包括如下重量百分比的组分：
【主权项】
1. 明亮发光杆菌冻干粉，其特征在于，包括如下重量百分比的组分：
2. 根据权利要求1所述的明亮发光杆菌冻干粉，其特征在于，包括如下重量百分比的 组分：
3. 根据权利要求1所述的明亮发光杆菌冻干粉，其特征在于，包括如下重量百分比的 组分：
4. 根据权利要求1~3任一项所述的明亮发光杆菌冻干粉，其特征在于，所述的菌体来 自于培养的明亮发光杆菌的菌液离心去上清后剩下的菌体。
5. 根据权利要求4所述的明亮发光杆菌冻干粉，其特征在于，菌体的制备方法如下：取 一支明亮发光杆菌（Photobacterium phosphoreum)EP管，将菌液接种到装有50ml培养基 的250ml锥形瓶中，根据前期优化的培养条件，接种量为2%，200r/min，pH7. 0,18°C振荡培 养 16-20h ; 所述培养基的配方： 酵母粉（Oxoid) 5. 0g，胰蛋白胨（Oxoid) 5. 0g，Na2HP045. 0g，KH2PO4L Og NaC130.0 g，甘油 3. Og，去离子水 1000ml ; 将培养好的菌液置于离心管中，7000~9000r/min下，优选8000r/min下，离心 20-30min，去除上清液，用重量浓度为3~10%的NaCl溶液洗涤、离心，去除上清液，收集沉 淀物，即为所述的菌体。
6.根据权利要求1~5任一项所述的明亮发光杆菌冻干粉的制备方法，其特征在于，包 括如下步骤： (1) 所述的菌体加入脱脂乳、海藻糖、精氨酸和氯化钠的混合物中，分散，然后置于安瓿 瓶中，-30~-20°C预冷1-2小时，再在-65~-75°C预冻8-12小时； (2) 将预冻后的安瓿瓶，放入真空冷冻干燥仪内，冷冻干燥至含水重量为3%以下，即 可获得所述的明亮发光杆菌冻干粉。
【专利摘要】本发明公开了一种明亮发光杆菌冻干粉及其制备方法，所述明亮发光杆菌冻干粉，包括如下重量百分比的组分：脱脂乳25～35％，海藻糖20～24％，精氨酸0.7～1.0％，氯化钠1～1.5％，菌体余量。本发明采用复合冷冻保护剂，试验证明，其抗冻能力大大提高，具有比单一的保护剂更强的保护性能，且具有很好的稳定性。本发明获得的明亮发光杆菌冻干粉，其发光度平均值为1843mv左右，接近模型预期值1820mv。并用制备的冻干粉对ZnSO4·7H2O、K2Cr2O7和C6H5OH的毒性进行检测，发现不同批次间的冻干粉测得的EC50值变异系数均小于6％。
【IPC分类】C12N1-20, C12R1-01, C12N1-04
【公开号】CN104762209
【申请号】CN201510144197
【发明人】冯耀宇, 李佩, 苏嘉缘, 孟芹, 胡越, 蔡敏
【申请人】华东理工大学
【公开日】2015年7月8日
【申请日】2015年3月30日