防治作物储藏期黄曲霉菌及毒素的海藻希瓦氏菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物病害生物防治技术领域，具体涉及一株防治储藏期黄曲霉菌侵染 和毒素产生的海藻希瓦氏菌及其应用，本发明还涉及该海藻希瓦氏菌YM8的筛选、鉴定、广 谱抑菌作用、抑菌气体代谢物检测及活性分析等，同时验证了不同水活度的仓储条件下，该 菌株在抑制花生与玉米黄曲霉病害与毒素污染中的应用。
【背景技术】
[0002] 黄曲霉菌（Aspergillus flavus)是一种广泛分布的腐生真菌。根据有性阶段将 其划分到子囊菌门（Ascomycota)、散囊菌目（Eurotiales)、发菌科（Trichocomaceae)、石 座菌属（Petromyces)。黄曲霉菌生长的最适水活度为0. 86 - 0. 96,最适温度为37°C，且在 12°C -48°C的温度范围内均可生长（Hedayati et al.，2007)。在炜度26° -35°的温带 气候地区黄曲霉菌是非常普遍的土壤微生物和植物病原菌，对恶劣环境的强适应能力使得 黄曲霉菌成为土壤中和植物上的优势微生物。在我国，黄曲霉菌的分布受气候影响明显，我 国长江流域和东南沿海地区的土壤中黄曲霉菌的种群数量明显多于黄河流域和东北地区 (张初署，2013)。
[0003] 黄曲霉菌既可以侵染花生、玉米、棉花等多种重要的经济作物，引起花生苗腐、玉 米穗腐等田间病害，又可严重为害储藏过程中的粮食，造成重大的经济损失。黄曲霉菌还 是人类和动物的致病菌。对于免疫力低下的人群，黄曲霉菌感染会引起侵袭性曲霉病，造 成皮肤、角膜、呼吸系统、循环系统和神经系统的疾病。黄曲霉菌还可以引起其他哺乳动物 和鸟类的曲霉病。黄曲霉菌在生长过程中还会产生大量的黄曲霉毒素，该毒素是一种剧毒 并且具有强烈致癌、致畸作用的微生物毒素，它对粮食、饲料等农产品的污染会严重危害人 类和动物的健康。由于食用受黄曲霉污染的花生饲料导致了超过10万只火鸡黄曲霉毒素 急性中毒死亡。据统计全世界受黄曲霉毒素危害的人口达50亿，在发展中国家黄曲霉毒 素污染尤为严重，人们在日常生活中长期受超过限量标准的黄曲霉毒素威胁（Williams et al.，2004)。由微生物产生的黄曲霉毒素主要有4种分别为黄曲霉毒素& (AFBD、B2 (AFB2)、 GJAFGD、G2(AFG2)。黄曲霉毒素是一类剧毒化合物并具有强烈的致癌性，AFBi是最常见的 黄曲霉毒素同时也是自然界中致癌性最强的化合物之一。一次性大剂量吸入或摄入黄曲霉 毒素可以引起急性中毒导致死亡。黄曲霉毒素污染粮食导致人中毒的现象在发展中国家尤 为严重，在肯尼亚就发生过因食用黄曲霉毒素污染的玉米导致数百人死亡的事件。在美国 发生过多例宠物狗因黄曲霉毒素中毒死亡的事件。长期接触黄曲霉毒素会诱发癌症（主要 是肝癌）、破坏免疫系统，引起畸形等一系列不良影响。黄曲霉毒素已经于1993年被国际 癌症研宄中心（IARC，International Agency for Research on Cancer)认定为 I 类致癌 物。世界上许多国家制定了严格的标准来限制黄曲霉毒素在食品中的残留。美国FDA组织 (Food and Drug Administration)规定在食品中黄曲霉毒素含量不得超过20yg/kg，牛奶 中不得超过〇. 5 y g/kg，饲料中不得超过300 y g/kg。欧盟对食品中黄曲霉毒素的限制标准 为4 yg/kg。因此黄曲霉毒素的污染将会给农业和畜牧业带来巨大的经济损失，在美国每年 因黄曲霉毒素污染造成的经济损失高达数亿美元。
[0004]目前黄曲霉及毒素的防治方法有常规育种、化学防治与生物防治三种手段。通过 育种手段可以将数量性状抗病基因整合到感病品种，选育新型的抗病新品种。近年来一些 重要的黄曲霉抗性相关QTLs陆续被定位，证明了基因的叠加效应能够增强植物对黄曲霉 菌的抗性。但总体而言，黄曲霉抗病材料匮乏，抗性基因的筛选与整合以及育种周期较长， 使得常规育种进展缓慢。化学防治作为最直接有效的手段被广泛应用于黄曲霉的田间及储 藏期的防治，但是长期的应用易引起药害和病原菌的抗药性，甚至污染环境。另外粮食作物 上直接喷洒化学农药容易导致残留，影响人体健康，在使用过程中饱受诟病。微生物源生物 制剂作为新型无危害的的防治策略，被逐渐开发和应用于黄曲霉和毒素的田间和储藏期防 治中。利用黄曲霉弱毒菌株或不产毒素菌株的竞争优势，可以优先占据了生态龛位，防止黄 曲霉感病菌株的侵染和毒素的进一步产生，对黄曲霉的田间和储藏期防治效果明显。目前 基于此开发的一种生防制剂af!a-guardK已经应用到花生黄曲霉病害防治当中（Dorner and Lamb，2006)。近年来利用微生物产生的挥发性气体防治储藏期病害发展迅速，微生物源的 挥发性气体因为其使用简单，散布均匀快速，接触广泛等优点被高效应用于储藏期病害的 生物防治。但是对黄曲霉及毒素的储藏期防治没有报道，基于此目的我们筛选了微生物菌 株，研宄其产气特性和抑菌作用，并开展储藏期黄曲霉毒素防治的研宄。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于针对花生与玉米等作物仓储期黄曲霉菌和黄曲霉毒素防治困 难，污染和经济损失严重的难题开展研宄，利用微生物学方法分离鉴定一株高效防治黄曲 霉菌和毒素污染的希瓦氏菌株YM8,利用该海藻希瓦氏菌株在培养基上产生的具有抑菌作 用的小分子挥发性代谢物质，可有效抑制花生和玉米等作物上黄曲霉病菌的侵染与毒素的 产生。
[0006] 实现本发明的技术方案如下所述：
[0007] 通过微生物学方法，本发明从中国辽宁省大连市渤海海域采集海洋沉积物，并从 中分离得到一株对黄曲霉有高效抑菌作用的海藻希瓦氏菌株。申请人将其命名为海藻希瓦 氏菌YM8，Shewanella algae YM8,于2015年3月17日将该菌株送交中国.武汉.武汉大 学中国典型微生物保藏中心（CCTCC)保藏，其保藏号为CCTCC NO :M 2015120。
[0008] 海藻希瓦氏菌（Shewanella algae) YM8的菌学特征：
[0009]海藻希瓦氏菌YM8革兰氏染色为阴性，杆状细菌，单端极生鞭毛，菌体大小为 0. 5ymX1.0ym~2. Oym(宽X长），生长温度范围为4-40°C，最适生长温度为25-35°C。 [0010]我们对该菌株的16S rDNA进行了鉴定，其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:1所示。 [0011] 本发明还对该菌株对黄曲霉菌菌丝和孢子的高效抑制作用，新型挥发性代谢产物 鉴定与抑菌作用，对黄曲霉在不同温度下的抑制作用以及对仓储条件下花生、玉米黄曲霉 与毒素的抑制作用进行了相关研宄。
[0012] 本发明的有益效果是：
[0013] (1)本发明分离的海藻希瓦氏菌YM8为深海细菌，从海底沉积物中分离得到的一 种高效新型抑菌微生物，可作为生防菌株应用。
[0014] (2)本发明分离的海藻希瓦氏菌YM8首次证明在密闭环境下，可产生气体物质具 有抑菌作用，可完全抑制黄曲霉菌丝的生长与孢子的萌发。
[0015] (3)本发明分离到的海藻希瓦氏菌YM8密闭空间内可以抑制病原真菌的生长，同 时可以抑制花生和玉米籽粒上的黄曲霉发病与毒素的合成。菌株YM8具有培养简单，使用 方便，分布广泛等优势，应用前景广泛。
[0016] (4)本发明得到的海藻希瓦氏菌YM8产生的挥发性物质具有抑菌作用，气相色谱 质谱联用仪检测到15种物质，验证了 6种主要物质对黄曲霉的抑制作用，证明两种物质抑 菌效果明显，可以作为潜在的杀菌剂开发应用。
[0017] (5)本发明得到的海藻希瓦氏菌YM8分离于深海，具有广温度适应性，在10-40°C 的温度范围内，可产生抑菌物质并抑制黄曲霉的生长。同时YM8具有广谱抑菌性，可完全抑 制筛选的其他8种重要病原真菌的生长。
[0018] 更详细的描述见《【具体实施方式】》。
【附图说明】：
[0019] 序列表SEQ ID N0 :1是本发明分离的海藻希瓦氏菌YM8的16S rDNA的序列。
[0020] 图1:海藻希瓦氏菌YM8在NA培养基上培养48h后的菌落形态。
[0021] 图2:海藻希瓦氏菌YM8的扫描电镜图片。
[0022] 图3 :海藻希瓦氏菌YM8菌株与其他近缘种菌株基于16s rDNA序列的系统发育树。
[0023] 图4:海藻希瓦氏菌YM8对黄曲霉菌的菌丝生长与孢子萌发的抑制作用。
[0024] 图5:海藻希瓦氏菌YM8与黄曲霉孢子共培养10h，12h和24h后的孢子萌发形态。 图5中的A，B，C图分别为黄曲霉孢子单独培养10, 12, 24h的形态；D，E，F图分别为黄曲霉 孢子与YM8对扣培养10, 12, 24h后的状态。
[0025] 图6:添加活性炭对海藻希瓦氏菌YM8抑菌作用的影响。
[0026] 图7:海藻希瓦氏菌YM8产生气体物质的GC-MS检测结果。图7中标注的物质为 购买的丰度和相似度较高的六种物质的保留时间以及化学结构图。
[0027] 图8:海藻希瓦氏菌YM8对不同水活度条件下玉米与花生黄曲霉与毒素的控制。图 8中A图是不同水活度下的花生与玉米接种黄曲霉后培养7天后的发病图片，图8中的B图 是7天后检测不同水活度下籽粒中的黄曲霉毒素含量。
[0028] 图9:水活度为0. 934下的花生培养7天后的扫描电镜观察。图9中的"对照"是 花生接种黄曲霉孢子培养7天后的电镜照片，图9中的"YM8"是花生接种黄曲霉孢子与YM8 共培养7天后的电镜照片。
[0029] 图10:海藻希瓦氏菌YM8的广谱抑菌作用。
[0030] 图11:海藻希瓦氏菌YM8广温范围内的抑菌活性检测。
【具体实施方式】
[0031] 实施例1候选菌株YM8的分离和菌学鉴定
[0032] (1)候选菌株YM8的分离
[0033] 我们通过微生物学方法，从中国辽宁省大连市渤海海域采集海洋沉积物，并从中 分离得到一株对黄曲霉有高效抑菌作用的海藻希瓦氏菌株，我们将该候选菌株YM8编号 为。
[0034] (1)YM8菌株的形态特征鉴定
[0035] YM8 菌株于 NA培养基（牛肉膏 3.0g/L，蛋白胨 10.0g/L，NaCl 5.0g/L，琼脂 15.0g/ L，补充蒸馏水至1L;调pH至7. 2)培养48h后