一种猪2型链球菌细胞壁蛋白抗体检测方法的建立及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及兽医微生物学及动物免疫学技术领域，具体涉及基于细胞壁蛋白SspA (Subtilisin-like serine protease, SspA，枯草菌素样丝氨酸蛋白酶)的重组大肠杆菌菌 株fccAericAia co/i BL21/pET28a-SspA，及利用该菌株表达的猪2型链球菌重组蛋白，建 立ELISA检测方法，适于与猪2型链球菌感染抗体的检测。
【背景技术】
[0002] 猪链球菌（Streptococcus suis)是一种能引起人、猪和其他动物感染、发病的重 要致病菌。根据荚膜多糖分型，猪链球菌有35个血清型，即1/2型和1-34型。其中猪 链球菌2型是毒力最强、流行最广的血清型。猪2型链球菌主要引起猪的脑膜炎、支气管 炎、心内膜炎、关节炎、脓肿等疾病，并可导致断奶仔猪死亡。人感染链球菌后，会引起脑 膜炎、心内膜炎、败血症和永久性失聪，严重时能引起人的死亡。自1968年荷兰首次报道 人感染脑膜炎病例后，有200多人因感染猪链球菌死亡。我国自七十年代以来有二十多个 省市已发生或流行，该病在我国广泛存在并严重流行，已成为当前严重危害养猪业发展的 一种主要疾病，不仅给养猪业造成巨大经济损失，而且也给人类造成了严重危害。
[0003] 目前对于猪2型链球菌的致病机制的研宄，主要集中在其毒力因子。已鉴定的猪 链球菌2型主要毒力因子有荚膜多糖（CPS)、溶菌酶释放蛋白（MRP)、细胞外蛋白因 子（EF)、溶血素（SLY)等。如谷氨酸脱氢酶（⑶H )、38 kDa蛋白、分泌核酸酶（ SsnA)、猪链球菌细胞壁蛋白（SspA)等，以及一些其它的潜在的毒力因子也与猪链球 菌的毒力相关。由于猪2型链球菌的致病机制尚不清楚，尚缺少有效的疫苗和敏感的诊断 方法，猪链球菌病一直未能得到有效的控制。
[0004] 为了有效地预防和控制猪链球菌2型病，在加强免疫预防的同时，使用特异、敏 感、快速、便于操作的诊断方法，为有效预防和控制猪链球菌2型的发生提供有力的手段和 重要的工具。目前，猪2型链球菌的预防控制仍然以灭活疫苗免疫为主，该灭活苗产生的抗 体对猪链球菌感染起到很好的保护作用。猪链球菌血清学抗体的评价方法有如琼脂扩散试 验及基于全菌、荚膜多糖为抗原的间接ELISA，华中农业大学研制了猪2型链球菌荚膜 多糖抗体的免疫试剂盒，并申请并获得了专利CN201210245250. 2,可用于检测猪链球菌血 清抗体，该方法对灭活疫苗和野毒感染产生的抗体均能检测，无法判断猪2型链球菌感染 抗体或免疫抗体。
[0005] -般来说，表面暴露蛋白和细胞壁附着蛋白常被作为疫苗的候选靶标和血清型诊 断试剂。SspA蛋白是通过体内诱导抗原技术鉴定到的，是一种细胞壁蛋白，在感染机体内大 量表达，而与免疫血清不能发生反应，因而可能作为一个诊断标识。鉴于SspA蛋白这些特 征，本发明采用克隆^5^基因重要的功能域片段，大量表达纯化出SspA蛋白，利用该蛋白 研制出快速、准确、安全、廉价的鉴别猪2型链球菌免疫猪与野毒感染猪的诊断试剂盒，为 猪2型链球菌的诊断及控制提供强有力的手段和工具。
【发明内容】
[0006] 本发明的第一个目的在于获得一株能够分泌猪链球菌2型细胞壁蛋白的重组大 肠杆菌，利用该重组大肠杆菌获得重组蛋白，利用该重组抗原蛋白制备猪2型链球菌血清 学抗体检测方法。
[0007] 实现本发明目的的技术方案为，申请人通过制备，获得一株能够分泌猪链球菌2 型免疫保护性抗原的重组大肠杆菌（focAericAia co/i) BL21/pET28a_SspA,该菌株已 于2014年7月21日送交湖北省武汉市武汉大学内的保藏在中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)，保藏编号为 CCTCC NO: M2014344。
[0008] 所述的抗原枯草菌素样丝氨酸蛋白酶SspA由序列表SEQ ID NO :1所示的核酸序 列基因编码表达得到。
[0009] 为使本发明技术方案公开完全，本发明重组大肠杆菌（ikcAericAia co/i) BL21/ pET-28a-SspA的构建过程如下： (1)猪2型链球菌基因组DNA的提取 将本实验室保藏的猪2型链球菌接种于含有10%灭活新生牛血清的TSA培养基上， 挑取单个菌落接种于TSB液体培养基中，置于摇床150 r/min，37°C震荡培养过夜。取 1. 0 ml菌液于1. 5 ml的离心管中，参照TIANGEN公司的细菌基因组DNA提取试剂盒的说 明书提取链球菌DNA。
[0010] (2)目的基因的扩增 根据GenBank上已经发表猪链球菌2型菌株基因的序列（GenBank登录号： CP000407.1)，应用 Primer Premier 5. 0 软件设计片段为 (328-3228 bp)的引物， 划线部分为引入的酶切位点I和免/ I。
[0011] 引物如下： SspA 上游引物 U 5，- GCGMTTCtggcattggtatatgcgcttccgat - 3' 下游引物 D 5，- CGTCGACcctacggtcaacttagaattgaagC - 3' 上、下游引物酶切位点外侧含有酶切保护碱基，分别为GC和C碱基。引物由上海生工 生物科技公司合成。将提取的DNA按50 y 1的体系进行PCR扩增。用1. 2%琼脂糖凝胶 电泳检测PCR反应产物。结果见图3,扩增条带大小与预期扩增片段大小相一致。
[0012] (3)表达重组质粒的构建与筛选 将目的基因片段的PCR扩增产物经相应的内切酶消化，并将pET28a载体经同样双酶 切，分别进行回收纯化，T4DNA连接酶连接后转化大肠杆菌DH5 a。用菌液筛选阳性克隆，将 阳性克隆的质粒进行测序。将重组质粒热击转化到大肠杆菌BL21感受态中，最终获得携带 有目的片段的原核表达载体。对pETZSa-^/^克隆产物用feoR I和进行双酶切鉴 定与预期大小相一致，进一步表明目的基因已成功克隆于表达载体中。
[0013] (4)猪2型链球菌SspA蛋白的诱导表达、纯化 将转化菌接种于含50yg/ mL卡那霉素（Kan )的LB琼脂平皿，37°C培养过夜。将培 养菌液1:100接种至20 mL含50 y g/ mL卡那霉素的LB培养基中，37°C，220r/min培养 至〇D_值达到0. 5-0. 7时，向培养液中加入诱导剂IPTG至终浓度为0. 5 mmol/L并设阴性 对照。28°C，180r/min培养6h。收集诱导后的菌液，离心得到的沉淀菌体反复冻融3次后 将菌体重悬于5 mL细菌裂解缓冲液中，并加入溶菌酶，冰上放置，用超声破碎5 min。将破 碎后的菌体离心收集沉淀，即粗包涵体，用10 mm〇l/L Tris-HCl洗涤沉淀，用枪头吹散、涡 旋洗涤使沉淀充分溶解，离心收集沉淀，重复洗涤2次，将初步纯化的重组蛋白加入0. 3% N-十二烷基肌氨酸钠（SKL)溶解，充分振荡，4°C溶解过夜后离心，取上清，在4 °C条件下 用磷酸盐缓冲液透析，期间换液至少3次，离心收集上清于透析袋中，用蛋白浓缩离心管浓 缩，过滤除菌获得纯化的蛋白，分装，一20°C保存备用。SDS-PAGE电泳分析表明，在IPTG 的诱导下，转化含有重组质粒的万.coB BL21表达了约112 kDa的融合蛋白，且表达产物大 小与预期一致。
[0014] (5) western blot 分析 表达产物经10 %的SDS-PAGE电泳后，用半干转移系统将蛋白转印至NC膜上，用含1 % BSA的TBS室温振荡封闭2h，然后进行Western Blot分析。将猪2型链球菌康复血清，高 免血清，健康猪血清（由华中农业大学国家微生物实验室惠赠）以及完全吸附的血清用1% 的牛血清白蛋白（BSA)按适当的比例稀释。加入1:1000稀释的血清于4°C孵育过夜，与 1:5000稀释的HRP标记的羊抗猪二抗室温振荡lh，用ECL进行发光显色反应。结果表明， 表达的重组蛋白能与感染血清反应，出现特异的条带，而不能与免疫血