莱茵衣藻细胞色素p450一氧化氮还原酶55b1的表达体系及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域，具体涉及莱茵衣藻细胞色素P450 55B1的原核表达及 表达产物应用于一氧化氮的荧光光谱法检测。
【背景技术】
[0002] 莱茵衣藻细胞色素P450 (CYP55B1)属于一氧化氮还原酶，即P450nor，被 Merchants S等人2007年于莱茵衣藻中发现，该酶对NO的催化机制如下：
[0003] Fe3++NI-Fe3+*N0 (1)
[0004] Fe3+*N0+NAD(P)H-I+NAD(P)+ (2)
[0005] I+N0+H+-Fe3++N20+H20 (3)
[0006] 但是目前还没有关于莱茵衣藻细胞色素P450 55B1的克隆、表达及酶功能应用的 报道。
[0007]自1986年NO被证实为血管内皮舒张因子以来，大量研宄结果表明，NO是重要的 生物信使分子，对生物体的生理过程起着重要的调节作用，因此，建立快速准确的生物体系 NO测定方法不仅能从本质上揭示某些生理现象，也为探索相关疾病的监控和病理研宄提供 技术保障。目前已有大量的直接检测NO的方法，如电子顺磁共振波谱、化学发光、质谱和荧 光已经被应该用于生物体NO的检测。但基于细胞色素P450 55B1荧光检测NO的方法未见 报道。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于克隆一种莱茵衣藻细胞色素P450 55B1的基因并在大肠杆菌 BL21中进行异源表达、表达产物纯化及NO的荧光检测应用。
[0009] 本发明所述的莱茵衣藻细胞色素P450-氧化氮还原酶55B1，所述一氧化氮还原 酶55B1的氨基酸序列如SEQIDNO. 1所示，该一氧化氮还原酶55B1由核苷酸序列如SEQ IDNO. 2所示的基因所编码，该基因为CYP55B1基因。
[0010] 本发明构建了莱茵衣藻细胞色素P450 -氧化氮还原酶55B1的表达体系，所述的 宿主为大肠杆菌BL21，所述的表达载体中定向插入有核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的基 因。
[0011] 上述表达体系的构建方法包括以下步骤：（1)CYP55B1基因0RF的扩增：先用touch down PCR分别扩增CYP55B1基因的5'端序列和3'端序列，再将以上两扩增后的片段等摩 尔量混合，通过重叠PCR扩增CYP55bl基因全长；本发明中根据NCBI中莱茵衣藻细胞色素 P450还原酶CYP55B1的基因的开放阅读框的序列（XM_001700220)，设计了两对引物P1/P2， P3/P4,所述引物的基因序列如SEQIDNO.3~SEQIDNO.6所示。其中5'端序列的上游 引物P1包含EcoRI限制性内切酶位点，3'端序列的下游引物P4包含HindIII限制性内切 酶位点。
[0012] (2)表达载体pET28a-55bl的构建
[0013] 采用￡(：〇1?1和出11(1111双酶切空载口￡1'-28&以及步骤（1)中的？0?产物0￥?55131 基因，分别回收1200bp的目的条带和5000bp的载体条带；将回收产物目的条带和载体条带 按摩尔比为3:1~10:1的量混合，并用T4连接酶于16°C下连接8h并热击转化大肠杆菌 DH5 a，制得pET28a-55bl载体；挑取单克隆，PCR扩增鉴定、用EcoR I和Hind III双酶切鉴 定及测序鉴定，测序结果正确。
[0014] (3)在大肠杆菌BL21细胞中表述上述pET28a-55bl载体。
[0015] 以上构建成功的载体热击转化到宿主菌大肠杆菌BL21，进行表达，并且纯化得到 了单一的目的蛋白。采用荧光光谱法，将异源表达的莱茵衣藻细胞色素P450 55B1酶用于 NO检测。
[0016] 所述的一氧化氮还原酶55B1荧光检测NO的方法，包括以下步骤：利用热击转化方 式，用pET28a-55bl载体转化大肠杆菌BL21，挑取阳性单克隆于37°C，180rpm条件下培养使 其0D600为0. 6,加入5-氨基酮戊酸，并加入终浓度为lmmol/L的IPTG，于28°C诱导表达 22h;离心10min后取菌体沉淀，用缓冲液处理后超声破碎8min，破碎4s停6s，将混合液于 4°C下离心12min，上清液采用Ni柱纯化，纯化后的蛋白样液进行C0差示光谱测定，测得蛋 白样液中一氧化氮还原酶55B1的浓度；
[0017] 在荧光比色皿中加入500 y L的蛋白样液，再加入2mL的0. lmol/L的中性的磷酸 缓冲溶液，通氮除氧30min后，固定激发波长为413nm，扫描600~680nm波长范围的荧光光 谱；然后在无氧条件下，加入NO储备液，并扫描光谱；然后进行平行实验，记录不同NO浓度 下对应的光谱强度，得到NO浓度与铁卟啉荧光强度变化的线性关系。
[0018] 本发明的有益效果在于，本发明首次克隆了 cyp55bl基因，构建了一氧化氮还原 酶55B1的原核表达体系，在大肠杆菌BL21中大量表达。此外本发明通过镍柱纯化蛋白而 得到了比较单一的一氧化氮还原酶55B1，基于一氧化氮还原酶55B1建立了 NO的荧光检测 法。
【附图说明】
[0019] 图1:PCR扩增莱茵衣藻细胞色素P450 55B1的5'端序列（680bp)结果，Lane l:MakerDL2000;Lane2:PCR扩增产物。
[0020] 图2:PCR扩增莱茵衣藻细胞色素P450 55B1的3'端序列（630bp)结果，Lane l:MakerDL5000;Lane2:PCR扩增产物。
[0021] 图3:重叠PCR扩增莱茵衣藻细胞色素P450 55B1基因结果（两端带有EcoRI和 HindIII)，Lanel:MakerDL5000;Lane2:重叠PCR产物。
[0022]图4:重组质粒pET28a-55Bl的EcoRI 和Hindlll双酶切鉴定结果，Lanel:Maker DL15000;Lane2-4:重组质粒pET28a-55Bl用EcoRI 和HindIII双酶切产物。
[0023] 图5:重组质粒pET28a-55BlPCR鉴定结果，Lanel:MakerDL5000;Lane2-4:重 组质粒pET28a-55Bl为模板PCR扩增CYP55B1。
[0024]图6:将质粒热击转化BL21后的单克隆PCR鉴定结果，Lanel:MakerDL5000 ; Lane2-6:重组质粒pET28a-55Bl热击转化BL21单克隆PCR产物；Lane7:质粒pET28a热 击转化BL21单克隆PCR产物。
[0025] 图 7:阳性克隆超声破碎 SDS-PAGE 结果，Lane 1:Protein Marker ;Lane 2-4:转 化空载pET-28a的BL21、重组菌诱导8h及22h的上清；Lane5-7:转化空载、重组菌诱导22h 及12h的混合；Lane 8-10:转化空载、重组菌诱导22h及12h的沉淀。
[0026] 图8:阳性克隆超声破碎western-blot结果，Lane 1、2:转化空载pET_28a的 BL21、重组菌诱导22h的上清；Lane3、4:转化空载pET-28a的BL21、重组菌诱导22h的混 合；Lane3、4:转化空载pET-28a的BL21、诱导22h的沉淀。
[0027] 图9:重组菌上清样的C0差光谱的测定。
[0028] 图10:空载转化BL21上清样的C0差光谱的测定。
[0029] 图 11:用 High Affinity Ni-charged Resin(GeneScript 公司）纯化上清蛋白 CYP55B1后样品的CO差光谱的测定。
[0030] 图 12:High Affinity Ni-charged Resin 纯化样品的 SDS-PAGE 结果，Lane l:Protein Maker;Lane 2、3:转化空载 pET_28a 的 BL21、重组菌诱导 8h 的上清；Lane 4:流 出液；Lane5:含10mM咪唑的洗脱液；Lane 6-12:含250mM咪唑的洗脱液，分别为El、E2、 E3、E4、E5、E6、E7、E8。
[0031] 图 13:High Affinity Ni-charged Resin 纯化样品的 western-blot 结果，Lane 1、2:转化空载pET-28a的BL21、重组菌诱导8h的上清；Lane 3、4:转化空载pET-28a的 BL21、重组菌诱导8h的混合；Lane 5、6:转化空载pET-28