一种热稳定性和催化效率提高的蔗糖异构酶突变体的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种热稳定性和催化效率提高的蔗糖异构酶突变体，属于基因工程和 酶工程技术领域。
【背景技术】
[0002] 蔗糖异构酶（EC 5. 4. 99. 11)，又称异麦芽酮糖合酶，蔗糖变位酶，是一种工业应用 价值极高的异构酶，属于a -淀粉酶13家族，可以高效催化异构蔗糖生成异麦芽酮糖和海 藻酮糖，异麦芽酮糖后续加氢可以生成异麦芽酮糖醇，异麦芽酮糖与异麦芽酮糖醇在医药 上具有极高的价值，两者口感与蔗糖相似，特别是两者不容易引起人体血糖的升高，非常适 合糖尿病患者的服用。利用蔗糖异构酶酶法转化蔗糖，与化学法合成异麦芽酮糖相比，具有 转化率高，反应时间短，生产成本低。因此，在工业生产中可以达到增加产量、提高设备利用 率、降低生产成本的目的。来源于Serratia plymuthica AS9鹿糖异构酶由600个氨基酸 组成，包含了三个结构域。在酶转化底物生产产物时，温度越高，可以抑制转化过程中微生 物的生长，防止酶在转化过程中被这些微生物降解。目前报道的大部分微生物来源的蔗糖 异构酶热稳定性均很差，本发明中野生蔗糖异构酶在50°C下半衰期仅为8min左右，45°C下 半衰期为40min。热稳定性差不利于鹿糖异构酶在工业上进行连续的酶转化以及酶的储藏 运输，因此，通过蛋白质分子改造提高蔗糖异构酶的稳定性显得尤为重要。
[0003] 在蛋白质分子改造中，目前常用的方法有理性设计、非理性设计和半理性设计。三 种方法的主要区别在于是否充分了解酶蛋白分子结构以及是否需要使用生物信息学软件 进行计算和预测。其中理性设计具有实验成本低、简单方便和时间短等优点。B因子（原子 取代因素）指的是由热运动和位置混乱引起的原子在其平衡位置周围电子密度的模糊度。 B因子越大，代表结构中一个氨基酸的活动范围越大，反之亦然。因此，氨基酸的B因子和 其柔性具有一定的关系，B因子高的氨基酸更容易发生形状的改变和位置的移动，具有更好 的柔性。反之，B因子低的氨基酸具有更好的刚性，不易发生变形和位移。在受热条件下， B因子高的氨基酸更容易受到影响而发生结构破坏，而导致酶活受到影响；而刚性好的B因 子低的氨基酸则能更好地保持其构象的稳定，而维持酶活力。因此将蔗糖异构酶中B因子 最高的氨基酸进行突变，降低其B因子，有可能提高酶的热稳定性。Rosetta Design软件可 以对突变位点进行稳定性突变的预测，通过计算，将柔性较高的氨基酸（B因子值较大）替 换成刚性增强的氨基酸。Rosetta Design通过计算得到的氨基酸，它们的疏水原子被隐藏， 它们的极性原子具有形成氢键的潜能，同时Rosetta Design预测得到的蛋白质骨架具有 更低的能量。
[0004] 发明人前期对来源于普城沙雷氏杆菌（S.plymuthica)的蔗糖异构酶进行了异源 表达和定点突变改造，获得了两个热稳定性和分泌性能得到提高的蔗糖异构酶突变体（一 种热稳定性和分泌效率提高的蔗糖异构酶突变体及其制备方法.2014102014687)。得到的 突变体K576D和K576P热稳定性和分泌效率都得到了一定的提高（K576D和K576P在45°C 下半衰期分别是野生酶的1. 8和1. 4倍；摇瓶发酵时两个突变体的胞外分泌效率分别是天 然酶的4. 6和4. 7倍），但是催化效率出现了不同程度的降低。为了进一步提高酶的应用性 能，本发明将B因子分析和Rosetta Design软件计算相结合，选择新的突变位点进行分子 改造，以进一步提尚鹿糖异构酶的热稳定性和催化效率。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的一个技术问题是提供一种蔗糖异构酶突变体，突变体与亲本蔗糖 异构酶相比有更好的热稳定性和催化效率。所述亲本基因与普城沙雷氏杆菌（Serratia plymuthica AS9)蔗糖异构酶基因（NCBI编号：NC_015567) -致，所述作为突变用的 质粒模板为携带天然蔗糖异构酶编码基因的载体palI/pET24a(+)(中国专利，【申请号】 2014102014687)。
[0006] 本发明的第一个目的是提供一种蔗糖异构酶突变体，所述突变体在氨基酸序列如 SEQ ID NO. 1的基础上，将第175位置的谷氨酸突变成天冬酰胺，命名为E175N。
[0007] 编码所述氨基酸序列的核苷酸序列，在本发明的一种实施方式中是SEQIDN0. 2 所示的序列。
[0008] 所述突变体，在本发明的一种实施方式中，还包括同时将第576位的赖氨酸突变 为谷氨酸，所得突变体命名为E175N/K576D。
[0009] 本发明的第二个目的是一种制备所述突变体的方法，包括如下步骤：
[0010] 1)对鹿糖异构酶晶体结构进行分析，确定B因子较高的氨基酸，并结合Rosetta Design软件分析确定突变成何种氨基酸可以降低B因子；
[0011] 2)设计定点突变所用引物，以携带蔗糖异构酶编码基因的载体为模板进行突变并 构建两种突变体的质粒载体；
[0012] 3)将突变质粒转化进宿主细胞；
[0013] 4)挑选阳性克隆进行发酵培养，纯化获得蔗糖异构酶突变体。
[0014] 本发明的第三个目的是提供一种含有所述突变体的氨基酸序列的重组质粒载体。
[0015] 所述质粒载体，在本发明的一种实施方式中，是pET系列、pGEX系列、pPICZ系列、 或PAN系列、或pUB中的任意一种。
[0016] 本发明的第四个目的是提供一种表达所述突变体的细胞。
[0017] 所述细胞，在本发明的一种实施方式中，是细菌、酵母或者真菌。
[0018] 本发明还要求保护所述突变体在生产异麦芽酮糖或海藻酮糖或异麦芽酮糖醇方 面的应用。
[0019] 本发明的有益效果：
[0020] 本发明构建了两个热稳定性和催化效率均得到了提高的蔗糖异构酶突变体E175N 和 E175N/K576D。
[0021] (1)热稳定性：在pH6.0,45°C的水浴中，突变体E175N和E175N/K576D的半衰 期为90. 2min和300min左右，相比天然蔗糖异构酶半衰期的39. 2min，分别提高了 130%、 665 % 〇
[0022] (2)催化效率：酶动力学分析显示，E175N和E175N/K57D的Km值分别比天然酶下 降了 6. 6%和11%;催化效率Keat/Km分别提高了 38%和19%。催化蔗糖生产异麦芽酮糖 时，突变体的异麦芽酮糖最大转化率分别比天然酶提高了 1.8%和1.6%。
[0023]因此，蔗糖异构酶突变体比亲本更适合蔗糖异构酶的运输保藏和在催化蔗糖生成 异麦芽酮糖过程中的应用。
【附图说明】
[0024] 图1 :天然蔗糖异构酶三维模拟结构；
[0025] 图2:天然酶与突变体在45°C、pH 6. 0保温20min后的残留酶活比较；
[0026] 图3:天然蔗糖异构酶及三种突变体纯酶SDS-PAGE凝胶电泳；其中，M代表蛋白分 子量标准，泳道1为天然蔗糖异构酶，泳道2为突变体E175N;泳道3为突变体K576D;泳道 4 为突变体 E175N/K576D;
[0027] 图4:天然蔗糖异构酶及其突变体的酶学性质比较，其中（a)为最适温度，（b)为 45 °C下的热稳定性；
[0028] 图5 :天然蔗糖异构酶及其突变体30°C下制备异麦芽酮糖的转化率。
【具体实施方式】
[0029]实施例1:蔗糖异构酶定点突变体的制备[0030] (1)蔗糖异构酶定点突变体的构建
[0031] 来源于S. plymuthica的蔗糖异构酶2种定点突变体E175N和E175N/K576D:
[0032] 本发明中，以相似度最高的Protaminobacter rubrum CBS 574. 77鹿糖异构酶 (SmuA)晶体结构（PDB ID: 3GBD)为模板，通过EMBI-EBL在线服务器构建了 S. plymuthica AS9蔗糖异构酶（Pall AS9)的三维模拟结构（图1)。通过氨基酸一级序列比对发现，SmuA 和Pall AS9两者之间只有一个氨基酸不同，相似度达到99. 86%，因此可以认为Pall AS9 有着SmuA近乎相同的三维结构和B因子参数。基于上述分析，选择Pall AS9中6个具有 较高的B因子的氨基酸残基（表1)，之后利用Rosetta Design软件将它们替换成刚性增强 的理想目标氨基酸。根据软件分析预测的结果，利用PCR介导的定点突变方法分别构建除 之前已成功构建的K576D的剩下5种突变体N577K、S575D、K174D、E175N和G176D。
[0033] 5种定点突变体的制备方法，根据S. plymuthica鹿糖异构酶的序列（氨基酸序列 如SEQ ID NO. 1所示，核苷酸序列如SEQ ID N0. 2所示），分别设计并合成引入定点突变的 引物，对蔗糖异构酶N577、S575、K174、E175和G176位置进行定点突变，测定DNA编码序列， 分别测序确认蔗糖异构酶突变体的编码基因是否正确；将突变体基因连接到适当的表达载 体中并导入大肠杆菌中进行表达，得到5种蔗糖异构酶定点突变体。
[0034] 定点突变体编码基因的PCR扩增：利