诺西肽生物合成控蛋白NosP的特异性结合序列及相关应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物次生代谢产物生物合成途径调控领域，具体涉及特异性调控蛋 白NosP在硫肽类抗生素诺西肽生物合成基因簇中特异性结合DNA序列的发现和验证，以及 通过NosP提高诺西肽在活跃链霉菌中生物合成效价的实际应用。
【背景技术】
[0002] 诺西肽（Nosiheptide)，又称多硫霉素，是由活跃链霉菌（Streptomyces actuosus ATCC 25421)产生的一种典型硫肽类抗生素，是最早被发现并投入使用的硫肽类抗生素之 一。诺西肽对革兰氏阳性菌具有广谱而强效的抑制作用，尤其是一些耐药菌如金黄色葡萄 球菌具有强力的杀伤作用。但由于其产量低、水溶性差、生物利用度低，目前只作为添加剂 被用于动物饲料中[McGinnis C，Poult Sci，1978, 57 (6) : 1641-1645.]。诺西肽属于e类硫 肽类抗生素，由12个氨基酸及其衍生物组成。它的结构已于1977年被鉴定[Prange T, et al, Nature, 1977, 265(5590) : 189-190.]，主要由2部分构成：骨架部分由5个噻唑环，1个 吡啶环构成；侧链部分由3-甲基-5-甲氧基-2-吲哚酸构成；骨架部分与侧链之间通过硫 脂键相连。
[0003] 链霉菌中抗生素的合成和链霉菌的生长过程密切相关，受到多层次的复杂调控， 这些调控途径的核心参与者常为蛋白质类的调控因子，按照调控因子发挥作用的范围可 粗略地将其分为2大类：全局性调控因子（global regulator)和途径特异性调控因子 (pathway-specific regulator)。对抗生素合成的第一层次的调控来源于全局性调控因 子（global regulators)，第二层次的调控来源于途径特异性调控因子。途径特异性调控 因子通常位于某种抗生素基因簇中，主要对生物合成基因簇内部基因具有特异性调控作用 的调控因子。途径特异性调控因子多数属于SARP (Streptomyces antibiotic regulatory Protein)家族[Wietzorrek A, et al, Mol Microbiol, 1997, 25(6) :1181_1184.]，常充 当信号级联系统中的最后一级效应蛋白，专一性地激活一个或几个抗生素基因簇的转录 [Martin JF，et al，J Ind Microbiol, 1992, 9 (2): 73-90.]，可对抗生素的生物合成效价产 生较强的影响。
[0004] 2009年，中科院上海有机所的刘文教授课题组成功钓取并测定了活跃链霉菌 (Streptomyces actuosus ATCC 25421)中约35kb的诺西肽生物合成基因族序列[Pascard C，et al，J Am Chem Soc，1977, 99(19) : 6418-6423.]，为诺西肽生物合成途径的研宄创造了 便利的条件。生物信息学分析显示，nosP基因位于S. actuosus诺西肽生物合成基因簇一 端，推测NosP蛋白属于SARP家族，参与诺西肽生物合成途径特异性调控，但其具体结合的 DNA序列以及对诺西肽生物合成效价的影响均属未知。
[0005] 通常SARP家族途径特异性调控蛋白可通过与生物合成基因簇中特定的DNA序列 结合，对抗生素合成相关基因的转录起到重要的调节作用，进而影响抗生素的最终发酵产 量。因此NosP结合DNA序列的发现和验证为通过遗传操作技术手段理性改造诺西肽生物 合成途径，提高诺西肽生物合成效价提供了理论和物质基础，对增加工业化生产诺西肽的 经济性和可行性具有广泛的实用价值和重要意义。
[0006]
【发明内容】
[0007] 本发明的发明目的是寻找和验证诺西肽生物合成途径中途径特异性调控蛋白 NosP的结合DNA序列，改造诺西肽生物合成基因簇，提高诺西肽的生物合成效价和发酵产 量，在此基础之上，通过萃取-结晶方法进一步简化诺西肽生产工艺和降低生产成本。
[0008] 为达到上述发明目的，本发明采用了的技术方案包括以下
【发明内容】
： (1) 构建含截短nosP基因的重组表达质粒，并在蛋白质的N端或C端添加纯化标签组 氨酸标签、GST、MBP中的任意一种，优选组氨酸标签； (2) 优化NosP的表达条件：37°C下将工程菌振摇培养至培养液0D600 = 0. 8±0. 1后， 加入0. 001-2mM的诱导剂IPTG，并优选出最佳浓度0. 2mM，在10~37°C下诱导培养8-24h， 优选出最佳表达温度和时间分别是16°C和16小时。
[0009] (3) NosP的纯化制备：采用镍柱亲和层析的方法纯化制备纯度大于95 %的NosP蛋 白。
[0010] (4)NosP的特异性结合序列：根据非编码区序列设计合成一系列探针，通过EMSA 和DNase I footprinting assay技术寻找活跃链霉菌诺西肽生物合成基因簇中的NosP特 异性结合序列并验证。
[0011] (5)采用不同方案改造诺西肽生物合成途径，提高诺西肽生物合成效价。
[0012] 本发明对诺西肽生物合成途径的调控机制认识具有重要的科学价值和意义，对诺 西肽产生菌株理性改造，提高诺西肽发酵效价，降低生产成本具有重要的实际应用价值。
【附图说明】
[0013]图 1 NosP 蛋白纯化 SDS-PAGE 图 图2 NosP蛋白与非编码区标记探针NCRL-M的EMSA实验图
【具体实施方式】
[0014] 以下进一步提供实施实例，这些实施实例有助于理解本发明，仅用作说明而不限 制本发明的应用范围。
[0015] 实施例1 以S. actuosus ATCC 25421基因组为模板，通过PCR扩增5'-端缺少207个碱基的截短 nosP基因，并在基因序列上下游分别插入限制性内切酶位点，利用本领域的技术人员熟悉 的酶切-连接方法，构建含有不同筛选标记的重组表达质粒：方案1 :借助酶切位点Ndel/ Hindlll和pET22b (+)在NosP的C-端插入组氨酸标签，获得重组质粒为pET22b-his-c ; 方案2 :借助酶切位点Nde I和Hindlll在NosP的N-端插入组氨酸标签，获得重组质粒为 pET28a-his-n ;方案2 :借助酶切位点BamH I和Xho I在NosP的N-端插入GST标签，获得 重组质粒为pGEX4T-gst-n.将上述重组质粒测序验证后分别转入E. coli BL21表达宿主 中，得到两种基因重组E. coli，按照标签的不同分别称为pHC工程菌、pHN工程菌和pHG工 程菌。
[0016] 实施例2 将实施例1中得到的三种基因重组E. coli分别在50mL的LB培养基（含100 y g/mL 氨苄青霉素或50yg/mL卡那霉素）中，37°C、220rpm振摇过夜培养获得相应的种子液。将 种子液按5%接种量转接至1^培养基（含10〇11 §/1^氨苄青霉素或5〇11§/1^卡那霉素） 中，37°C振摇培养至培养液0D6QQ= 0. 8±0. 1时，加入终浓度为0. 001-2mM的诱导剂IPTG， 在25°C条件下，诱导培养20小时，得到工程菌株E. coli发酵液。在4°C、4500rpm条件下离 心15min收集发酵菌体，菌体经40mM的Tris-HCl缓冲液（pH 8. 0)洗涤两次，收集菌体用 于SDS-PAGE分析。结果发现pHC、pHN和pHG三株工程菌均在0. 2mM IPTG条件下获得最佳 可溶性表达量，NosP的含量分别占总蛋白量的8. 5%、7. 8%和7. 1%。
[0017] 实施例3 将实施例1中得到的三种基因重组E.Coli分别在50mL的LB培养基（含100yg/mL氨 苄青霉素或50yg/mL卡那霉素）中，37°C、220rpm振摇过夜培养获得相应的种子液。将种 子液按5%接种量转接至1^培养基（含10〇11 §/1^氨苄青霉素或5〇11§/1^卡那霉素）中， 37°C振摇培养至培养液0D6QQ= 0. 8±0. 1时，加入终浓度为0. 2mM的诱导剂IPTG，在10~ 37°C条件下，诱导培养20小时，得到工程菌株E. coli发酵液。在4°C、4500rpm条件下离心 15min收集发酵菌体，菌体经40mM的Tris-HCl缓冲液（pH 8. 0)洗涤两次，收集菌体用于 SDS-PAGE分析。结果发现在16°C条件下pHC、pHN和pHG三株工程菌中NosP可溶性表达量 达到最大值，分别占总蛋白量的9. 3 %、8. 4 %和8. 1 %。
[0018] 实施例4 将实施例1中得到的三种基因重组E.coli分别在50mL的LB培养基（含100yg/mL氨 苄青霉素或50yg/mL卡那霉素）中，37°C、220rpm振摇过夜培养获得相应的种子液。将种 子液按5%接种量转接至1^培养基（含10〇11 §/1^氨苄青霉素或5〇11§/1^卡那霉素）中， 37°C振摇培养至培养液0D6QQ= 0. 8±0. 1时，加入终浓度为0. 2mM的诱导剂IPTG，在16°C 条件下，诱导培养8-24h小时，得到工程菌株E. coli发酵液。在4°C、4500rpm条件下离心 15min收集发酵菌体，菌体经40mM的Tris-HCl缓冲液（pH 8. 0)洗涤两次，收集菌体用于 SDS-PAGE分析。在诱导16小时条件下pHC、pHN和pHG中NosP可溶性表达量已达到平台 期，分别占总蛋白量的9. 5%、8. 8%和8.