一种细胞系法检测热原的方法及其试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药领域，具体涉及一种细胞系法检测热原的方法及其试剂盒。
【背景技术】
[0002] 热原（pyrogen)指由微生物产生的能引起恒温动物体温异常升高的致热性物 质。各国药典收载的热原检测法包括家兔热原检查法和细菌内毒素检查法（bacterial endotoxins test，BET)。家兔法于1942年被美国药典首次收录，至今被认为是检测热原的 "黄金标准"，但其也存在一些缺点：如只能给出阴性或阳性的定性结果、灵敏度低、结果重 复性差，结果准确与否依赖于兔子品系的选择和实验条件的控制；费用较高；使用活体动 物进行体内实验等。细菌内毒素检查法，也被称作豐试验法（limulus amoebocyte lysate test, LAL)，LAL法主要的优点是利用细菌内毒素标准品，可以半定量或全定量检测细菌内 毒素、灵敏度高。但该方法最大的缺点是它只能特异性地检测革兰氏阴性菌来源的细菌内 毒素，不适用于检测其他种类的热原物质。然而随着人们对动物福利问题的日益关注、鲎资 源日益匮乏及药品研制技术的发展，尤其是以病毒、细菌为原料的相关生物技术制品的出 现，传统热原检测方法用于产品的质量控制正面临严峻的挑战。因此，目前倾向于采用细胞 系法或全血法来检测热原刺激后细胞因子的变化来代替传统的检测方法。
[0003] 近年来，单核细胞系法成为热原检测研宄热点。目前已有7种方法（新鲜人全 血-IL-1 0、新鲜人全血-IL-6、PBMC-IL-6、MM6-IL-6、THP-1-新蝶呤（Neo)、THP-1-TNF-a 和冻存人全血-IL-1 )分别于2004、2005年得到欧洲权威机构（例如欧洲替代方法论证 中心（European Centre for the Validation of Alternative Methods，ECVAM)，英国国家 生物制品检定所（National Institute for BIOLOGICAL Standards and Control，NIBSC) 等）的正式验证与推荐。尽管细胞系法似乎更符合要求：不使用动物，能真实模拟人体对热 原的反应，并且能定量或半定量地检测出较多种类的热原物质，操作简便等，但其需要找到 合适的细胞，目前研宄比较热门的细胞如MM6亚克隆细胞，较难得到，不适合广泛的推广， 而THP-1细胞灵敏度较低，剂量依赖性较差，因此利用细胞系法进行热原检测存在许多亟 待解决的问题。
【发明内容】
[0004] 本发明针对现有技术中检测热原的方法只能检测革兰氏阴性菌来源的细菌内毒 素、细胞难以获得、灵敏度低、剂量依赖性差等缺陷，提供一种细胞系法检测热原的方法及 其试剂盒，所述的方法能够对革兰氏阴性菌来源、革兰氏阳性菌来源和酵母来源的热原物 质进行定性和定量分析、灵敏度高、剂量依赖性好，而且HL-60细胞市售易得，适合于应用 推广。所述的试剂盒操作简便、可以对热原物质进行定性和定量分析，灵敏度高。
[0005] 发明人经过广泛的研宄和反复的试验，发现HL-60细胞在经过本发明方法培养 后对热原物质敏感，能够用于细胞系法检测热原，因此发明人发明了一种细胞系法检测热 原的方法，并且从HL-60细胞的细胞密度、热原物质的作用时间、热原物质或待检样品的浓 度、细胞培养液的种类和HL-60细胞的细胞代次等多个试验参数进行选择和优化，从而建 立一个良好的热原检测方法的模型。
[0006] 本发明提供一种细胞系法检测热原的方法，其包括以下的步骤：
[0007] (1)制备热原物质的标准溶液和待检样品的溶液；
[0008] (2)将步骤（1)所述的热原物质的标准溶液或待检样品的溶液分别加入含有 HL-60细胞的细胞培养液中培养，取培养后细胞的上清液；
[0009] (3)检测步骤（2)所述细胞的上清液中细胞因子IL-6的含量。
[0010] 其中，所述的HL-60细胞又称人白血病细胞。
[0011]所述的细胞因子IL-6又称白细胞介素-6,属于内源性致热源，会引发热原反应。
[0012] 步骤（1)为：制备热原物质的标准溶液和待检样品的溶液。其中，所述的热原物质 为本领域常规的热原物质，较佳地为革兰氏阴性菌来源的热原物质、革兰氏阳性菌来源的 热原物质和酵母来源的热原物质中的一种或多种，更佳地为细菌内毒素、脂壁酸和酵母多 糖中的一种或多种。
[0013] 所述的待检样品为注射液；较佳地，为静脉注射液或肌肉注射液。
[0014] 所述的热原物质的标准溶液的制备方法为本领域常规的制备方法，较佳地为用稀 释液稀释所述的热原物质。所述的待检样品的溶液或为待检样品本身，或将待检样品用稀 释液稀释。所述的稀释液为本领域常规的稀释液，较佳地为含0.5~20%胎牛血清（FBS) 的IMDM(Iscove' s Modified Dubecco' s Medium)培养液，更佳地为含1~10%胎牛血清 的MDM培养液，最佳地为含2~5%胎牛血清的MDM培养液，所述的百分比为胎牛血清占 MDM培养液的体积百分比。
[0015] 步骤（2)为：将步骤（1)所述的热原物质的标准溶液或待检样品的溶液分别加入 含有HL-60细胞的细胞培养液中培养，取培养后细胞的上清液。其中，所述的热原物质的标 准溶液或待检样品的溶液的与所述的细胞培养液的体积比为本领域常规的体积比，较佳地 为 1:1 ~1:4〇
[0016] 所述的细胞培养液为本领域常规的细胞培养液，较佳地为含0. 5~20 %胎牛血清 的MDM培养液，更佳地为含1~10%胎牛血清的MDM培养液；最佳地为含2~5%胎牛血 清的MDM培养液，所述的百分比为胎牛血清占MDM培养液的体积百分比。
[0017]所述的HL-60细胞的细胞密度为本领域常规的细胞密度，较佳地为IX 105个/ mL~5X 107个/mL，更佳地为5X 10 5个/mL~5X 10 7个/mL，最佳地为IX 10 6个/mL~ 1X107个/mL〇
[0018] 所述的HL-60细胞按本领域常规的步骤培养，较佳地，按包括以下步骤的方法培 养：将HL-60细胞在含10~25%胎牛血清的MDM培养液中培养，即可，所述的百分比为胎 牛血清占頂DM培养液的体积百分比。所述的培养的时间为本领域常规的时间，较佳地为 2~3天。所述的培养的温度为本领域常规的温度，较佳地为37°C。所述培养的二氧化碳 浓度为本领域常规的浓度，较佳地为5 %，所述的百分比为体积百分比。较佳地，将HL-60细 胞在含15~25%胎牛血清的MDM培养液中培养；更佳地，将HL-60细胞在含15~20%胎 牛血清的MDM培养液中培养，所述的百分比为胎牛血清占MDM培养液的体积百分比。 [0019] 较佳地，所述的HL-60细胞是经过传代培养的HL-60细胞。所述的传代培养的代数 为本领域常规的代数，较佳地为所述HL-60细胞复苏后2~30代，更佳地为所述HL-60细 胞复苏后5~15代。所述的传代培养的条件和步骤为本领域常规的条件和步骤，较佳地， 用含10~25%胎牛血清的MDM培养液将HL-60细胞于5%，37°C二氧化碳培养箱内培养， 每2~3天更换细胞培养液一次，即可，所述的百分比为胎牛血清占MDM培养液的体积百 分比。其中，所述的细胞培养液为本领域常规的细胞培养液，较佳地为10~25%胎牛血清 的MDM培养液；更佳地为含15~25%胎牛血清的MDM培养液，最佳地为含15~20%胎 牛血清的MDM培养液，所述的百分比为胎牛血清占MDM培养液的体积百分比。
[0020] 所述的培养的时间为本领域常规的时间，较佳地为1~4天，更佳地为1~3天， 最佳地为1~2天。所述的培养的温度为本领域常规的温度，较佳地为37°C。所述培养的 二氧化碳浓度为本领域常规的浓度，较佳地为5 %，所述的百分比为体积百分比。
[0021] 步骤（3)为：检测步骤（2)所述细胞的上清液中细胞因子IL-6的含量。其中， 所述的检测的方法为本领域常规的方法，较佳地为酶联免疫吸附试验（e n z y m e -1 i n k e d immunosorbent assay，ELISA)法。
[0022] 较佳地，所述的热原检测方法还包括以下的步骤：
[0023] (4)根据步骤⑶检测的细胞因子IL-6的含量，得到热原检测的结果。
[0024] 本发明中的一个较佳实例是：