一种用于检测高邮鸭低腹脂率的分子标记方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于畜禽分子生物学技术领域，具体涉及一种与鸭腹脂率相关的用于检测 高邮鸭低腹脂率的分子标记方法，该分子标记方法可应用于鸭标记辅助选择育种。
【背景技术】
[0002] 高邮鸭原产江苏省高邮，为我国著名善产双黄蛋的蛋肉兼用型优良品种，并已被 列入国家级畜禽品种资源。但高邮鸭体型偏大，基础消耗高，而作为蛋肉兼用型品种，产蛋 率又比其它品种低，因此如何培育出生长速度快、脂肪含量低的性状是育种中首先要考虑 的重点。高邮鸭的选育工作已经开展了二十多年，蛋用鸭的选育业已取得了一些显著的成 效，如高邮鸭的产蛋数从150个提高到210个左右。但肉用品系的选育工作相对滞后，随着 肉用消费量的不断增加，培育出脂肪率低的新品种成为高邮鸭育种的艰巨任务。随着分子 生物学技术的发展，人们可以通过寻找控制脂肪沉积的主基因或与其连锁的分子标记，从 而通过分子标记实施早期选择及间接选择。目前，尽管在鸭脂肪沉积候选基因鉴定和应用 方面取得了一些进展，但能够真正能用于选择低腹脂率进行育种实践的很有限，因此非常 有必要寻找有效的能够影响鸭脂肪沉积的候选基因及分子标记。
[0003] 极低密度脂蛋白受体（VLDLR)是一种细胞膜表面的蛋白质，由846个氨基酸组成， 是含ApoE的脂蛋白颗粒等多种不同配体的受体。极低密度脂蛋白受体有着5个功能结构 域：配体结合结构域、表皮生长因子前体结构域、含糖基结构域、跨膜结构域和胞内结构域。 它主要负责结合和内移含载脂蛋白，如极低密度脂蛋白（VLDL)，向肝外组织提供甘油三酯 作为能量来源。许多研宄表明，极低密度脂蛋白受体在脂肪酸代谢活跃的组织，如心脏、骨 骼肌和脂肪组织中含量丰富，而且能够选择性地和载脂蛋白E、富含甘油三酯的脂蛋白结 合。有关VLDLR的研宄大都集中在人类，研宄发现人VLDLR基因的突变会导致血脂代谢紊 乱，而血脂异常与动脉粥样硬化密切相关，属心脑血管疾病，因此受到了广泛关注和深入研 宄。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种用于检测高邮鸭低腹脂率的分子标记方法及应用。是 通过对影响脂肪沉积的VLDLR基因的DNA标记，选育低腹脂率的优质高邮肉鸭，实现分子标 记辅助育种。
[0005] 实现本发明的技术方案是：
[0006] 一种用于检测高邮鸭低腹脂率的分子标记方法，包括以下步骤：
[0007] 以包含VLDLR基因的待测高邮鸭全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩 增高邮鸭基因，扩增长度为676bp，引物对P上下游引物序列为：
[0008] 上游 5' -TTCCTTCCTCATCCTCTTGCTC-3' ；
[0009] 下游 5' -GCCTCCATCTGCCATGTTCT-3' ；
[0010] 产物经琼脂糖凝胶电泳检测后进行纯化测序，测序鉴定高邮鸭VLDLR基因表皮生 长因子前体同源结构域多态性；
[0011] 对公鸭/母鸭VLDLR基因单倍型组合与屠宰性状之间进行关联分析，发现能影响 脂肪沉积和腹脂率的有效分子标记信息，从而培育出低腹脂率的优质高邮肉鸭品系。
[0012] 进一步，所述PCR扩增反应体系为25 y L，反应程序为94°C预变性5min，然后循环 以下操作：94°C变性30s，53. 5°C退火30s，72°C延伸35s ;最后72°C延伸lOmin，4°C保存。
[0013] 进一步，所述纯化测序是以引物对P作为测序引物进行纯化双向测序，使用PHASE 软件统计SNP位点的单倍型、单倍型频率及构建单倍型组合。根据GenBank登录的鸭 VLDLR(GenBank序列号：HQ446852. 1)序列，设计引物，扩增VLDLR基因表皮生长因子前体同 源结构域，扩增长度为676bp，产物经电泳检测后进行纯化双向测序。测序结果与NCBI序列 (HQ446852. 1)进行比对分析，得到8个多态位点及其分型情况：
[0014] 第一个位点位于第14内含子，第167位点发生G - A突变；第二、三位点位于第 15外显子，分别在231处发生C - T突变、243处发生G - A突变；其余5个多态位点位于 第15内含子，分别是356与357位点的碱基CT插入，第359位点的碱基T缺失，第498位 点的C - T突变，第563与567位点的碱基GA插入，第631位点的G - A突变。
[0015] 根据VLDLR基因表皮生长因子前体同源结构域的8个SNP位点，共确定出8个主 要的单倍型（频率高于1% )，分别定义为Hl、H2、H3、H4、H5、H6、H7和H8。根据VLDLR基 因单倍型，采用PHASE软件在公母两个群体中分别构建了 4种和6种单倍型组合，公鸭单倍 型组合组合和个数为H1H1 (34)，H1H2 (38)，H2H4 (9)和H3H3 (7);母鸭单倍型组合组合和个 数为 H1H1 (55)，H1H2 (16)，H1H5 (22)，H3H3 (15)，H3H4 (6)和 H6H6 (6)。为避免观测个体数较 小，造成误差过大，去除个数小于3的单倍型组合。分析VLDLR基因单倍型组合和屠宰性能 特别是腹脂率的相关性。
[0016] 本发明所述的与高邮鸭屠宰性状相关的VLDLR基因分子标记可以应用于鸭标记 辅助选择育种中。
[0017] 本发明与现有技术相比，其显著优点是：
[0018] (1)在鸭身上首次证实了 VLDLR的多态性和脂肪沉积有关。
[0019] (2)为鸭脂肪沉积标记辅助育种提供了一种新的分子标记方法，以期培育出低腹 脂率的优质尚邮肉鸭品系。
【附图说明】
[0020] 图1是高邮鸭VLDLR表皮生长因子前体同源结构域PCR扩增产物琼脂糖凝胶检测 电泳图。
[0021] 图2是VLDLR基因表皮生长因子前体同源结构域的多态位点基因型图谱。
【具体实施方式】
[0022] 为了更好地理解本发明，下面通过具体的实施例来具体说明本发明的技术方案。
[0023] 实施例1
[0024] 1 ?实验材料
[0025] 在高邮鸭繁育基地内，随机选取280只保种场高邮鸭（公母各半），实验鸭群常规 饲养，饲养期有水池和活动场地，每周早上空腹称重，地面平养至第10周。10周龄后翅静脉 采血，抗凝后保存，用常规酚/氯仿抽提法提取基因组DNA。测定活体重量后进行屠宰，测定 屠体性能指标。屠宰测定按照全国家禽育种委员会统一标准进行，测定全净膛重、腹脂重， 并计算腹脂率。腹脂率=腹脂重八全净膛重+腹脂重）。
[0026] 2?弓丨物设计与扩增
[0027]根据 GenBank 登录的鸭 VLDLR(GenBank 序列号：HQ446852. 1)序列，用 Primer5. 0 设计引物，扩增长度为676bp，上下游引物序列为：
[0028]上游 5' -TTCCTTCCTCATCCTCTTGCTC-3'；
[0029]下游 5' -GCCTCCATCTGCCATGTTCT-3'
[0030] 按照上述设计的引物进行PCR扩增，PCR扩增反应体系为25 y L :DNA模板1 y L， 上、下游引物各11^，2\￡387 139?〇?5即口61]\^112.