实时荧光pcr检测家蚕传染性软化病病毒的方法及其试剂盒、引物和探针的制作方法

文档序号:8442366阅读:301来源:国知局
实时荧光pcr检测家蚕传染性软化病病毒的方法及其试剂盒、引物和探针的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域,尤其涉及实时荧光PCR检测家蚕传染性软化病病毒的 方法及其试剂盒、引物和探针。
【背景技术】
[0002] 传染性软化病病毒属细小核糖核酸病毒科(Picornaviridae),是线性单链RNA病 毒,是造成家蚕软化病的病原物,也是造成世界蚕业经济损失的一大元凶。由于对上述蚕病 缺少有效的控制手段,因此早期的对病原微生物的检测鉴定非常重要,准确灵敏的检测方 法能有效的防止疾病的传播,减少经济损失。
[0003] 显微镜被广泛用于家蚕病原微生物的检测,但由于传染性软化病病毒所引起的病 症和某些其他病毒及细菌引起的病症相似,因此用普通光学显微镜较难确诊。即便确诊,受 显微镜法特异性和灵敏度的限制,也很难实现早期诊断。血清学鉴别法具有特异性强、灵敏 度高的特点,但是存在比较高的交叉反应与非特异性反应。随着分子生物技术的发展,传染 性软化病病毒可通过在保守区域设计特异性引物,将病毒RNA反转录成cDNA后,进行PCR 检测。实时荧光PCR (Real-time PCR)是在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号 积累实时监测整个PCR进程,最后通过扩增曲线对结果进行分析。

【发明内容】

[0004] 本发明的第一个目的是提供一种实时荧光PCR检测家蚕传染性软化病病毒 )的引物和探针,本发明的第二个目的是提供采用上述的引 物和探针的检测试剂盒,本发明的第三个目的是一种实时荧光PCR检测家蚕传染性软化病 病毒的方法。本发明实现在家蚕中对上述病原微生物的快速早期诊断。
[0005] 为了实现上述第一个目的,本发明采用以下技术方案: 实时荧光PCR检测家蚕传染性软化病病毒() 的引物和探针,上游引物的序列为GGGAAAGTCGATGAATGCCC,下游引物的序列为 AAGTGTGCCCAGSTATARCT,下游引物中S随机采用G或C替代,R随机采用A或G替代,所述 的探针为 FAM- ITGAGGAGAACGCCAAGGAA -Eclipse。
[0006] 为了实现上述第二个目的,本发明采用以下技术方案: 一种用于实时荧光PCR检测家蚕传染性软化病病毒的试剂盒,该试剂盒包括引物和探 针,上游引物的序列为GGGAAAGTCGATGAATGCCC,下游引物的序列为AAGTGTGCCCAGSTATARCT, 下游引物中S随机采用G或C替代,R随机采用A或G替代,所述的探针为?八11_ TTGAGGAGAACGCCAAGGAA -Eclipse。
[0007] 为了实现上述第三个目的,本发明采用以下技术方案: 实时荧光PCR检测家蚕传染性软化病病毒的方法,该方法包括以下的步骤: 1)样本RNA提取及cDNA的合成 选取感染上述微生物的家蚕幼虫,以中肠为提取RNA的对象;取0. 2g上述样品,在液氮 中充分研磨后,使用RNA抽提试剂盒UNIQ-10进行RNA抽提,抽提后的RNA用DNasel处理; 取适量的RNA,利用反转录试剂盒,将RNA反转录成cDNA,cDNA稀释5倍后可用于Real-time PCR检测; 2) 实时荧光PCR扩增检测 上游引物的序列为GGGAAAGTCGATGAATGCCC,下游引物的序列为 AAGTGTGCCCAGSTATARCT,下游引物中S随机采用G或C替代,R随机采用A或G替代,所述的 探针为 FAM- ITGAGGAGAACGCCMGGAA -Eclipse;实时荧光 PCR 反应体系如下:10ul Premix Ex Taq,上游引物0. 4ul,浓度为10 pmol/yl,下游引物0. 4ul,浓度为10 pmol/yl,探针 0. 4ul,浓度为10 pmol/yl,取上述稀释后的cDNA液lul,用水补足体积至20ul。应用荧 光定量 PCR 仪 lightcycle 480 进行反应,反应程序为(1) 95°C,10 sec;(2) 95°C,5 sec; 60°C,23 sec ;40 个循环; 3) 结果判定 Ct值小于等于35时,结果为阳性,Ct值大于35时为阴性。
[0008] 本发明由于采用了上述的技术方案,提供了一种利用Real-time PCR技术对家蚕 传染性软化病病毒进行检测的方法。由于引物和探针具有很高的特异性和灵敏度,提高了 早期检测的检出率,并简化了检测方法。本发明能提高家蚕中上述病原物的早期检测的检 出率,可有效的防止疾病的传播,减少经济损失。
【具体实施方式】
[0009] 实施例1:引物和探针的设计 基于家蚕传染性软化病病毒RNA序列(HM245295. 1,HM569717. 1,EU868609. 1, EF422866. 1,AB000906. 1 (基因序列号)),用生物信息学方法根据引物设计原则,并利用 Primer Express设计软件设计了符合"印度株"、"日本株"和"浙江株"各自特异性的引物 和荧光探针各一组。利用DNAStar软件,将上述两组引物和探针进行序列比对,设计了可 同时检测上述三种株系的通用引物和探针一对(表1)。将设计得到的引物和探针一一进行 BLAST验证(http://blast. ncbi. nlm. nih. gov/),验证结果显示,不论引物或探针,与之完 全匹配的碱基序列都显示为"传染性软化病病毒"序列,保证了引物探针的高特异性。
[0010] 表1家蚕微粒子、核型多角体病毒和浓核病毒检测的引物和探针
【主权项】
1?实时荧光PCR检测家蚕传染性软化病病毒Kirw1S)的引 物和探针,其特征在于:上游引物的序列为GGGAAAGTCGATGAATGCCC,下游引物的序列为 AAGTGTGCCCAGSTATARCT,下游引物中S随机采用G或C替代,R随机采用A或G替代,所述 的探针为FAM-ITGAGGAGAACGCCAAGGAA-Eclipse。
2. -种用于实时荧光PCR检测家蚕传染性软化病病毒的试剂盒,其特征在于该试 剂盒包括引物和探针,上游引物的序列为GGGAAAGTCGATGAATGCCC,下游引物的序列为 AAGTGTGCCCAGSTATARCT,下游引物中S随机采用G或C替代,R随机采用A或G替代,所述 的探针为FAM-ITGAGGAGAACGCCAAGGAA-Eclipse。
3. 实时荧光PCR检测家蚕传染性软化病病毒的方法,其特征在于该方法包括以下的步 骤: 1) 样本RNA提取及cDNA的合成 选取感染上述微生物的家蚕幼虫,以中肠为提取RNA的对象;取0. 2g上述样品,在液氮 中充分研磨后,使用RNA抽提试剂盒UNIQ-10进行RNA抽提,抽提后的RNA用DNaseI处理; 取适量的RNA,利用反转录试剂盒,将RNA反转录成cDNA,cDNA稀释5倍后可用于Real-time PCR检测; 2) 实时荧光PCR扩增检测 引物探针序列采用权利要求1所述的引物和探针,实时荧光PCR反应体系如下:10ul PremixExTaq,上游引物0.4ul,浓度为10pmol/yl,下游引物0.4ul,浓度为10pmol/ y1,探针0. 4ul,浓度为10pmol/y1,取上述稀释后的cDNA液lul,用水补足体积至20ul, 应用荧光定量PCR仪Iightcycle480进行反应,反应程序为(I) 95°C,10sec;(2) 95°C, 5sec;6CTC,23sec;40 个循环; 3) 结果判定 Ct值小于等于35时,结果为阳性,Ct值大于35时为阴性。
【专利摘要】本发明属于生物技术领域,尤其涉及实时荧光PCR检测家蚕传染性软化病病毒的方法及其试剂盒、引物和探针。上游引物的序列为GGGAAAGTCGATGAATGCCC,下游引物的序列为AAGTGTGCCCAGSTATARCT,下游引物中S随机采用G或C替代,R随机采用A或G替代,所述的探针为FAM- TTGAGGAGAACGCCAAGGAA –Eclipse。本发明由于引物和探针具有很高的特异性和灵敏度,提高了早期检测的检出率,并简化了检测方法。本发明能提高家蚕中上述病原物的早期检测的检出率,可有效的防止疾病的传播,减少经济损失。
【IPC分类】C12N15-11, C12R1-93, C12Q1-70, C12Q1-68
【公开号】CN104762415
【申请号】CN201510120660
【发明人】吴姗, 董强, 鲁兴萌, 朱青青, 张瑾
【申请人】浙江省检验检疫科学技术研究院
【公开日】2015年7月8日
【申请日】2015年3月19日
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