GFRα3的人抗体及其使用方法
【专利说明】GFRa3的人抗体及其使用方法 发明领域
[0001] 本发明涉及与人胶质细胞系来源的神经营养因子（GDNF)家族受体a3(GFRa3) 特异性地结合的人源抗体和人源抗体的抗原结合片段，以及使用这些抗体的治疗方法。
[0002] 相关领域的声明
[0003] 胶质细胞系来源的神经营养因子相关家族由胶质细胞系来源的神经营养因子 (GDNF)、neurturin(NRTN)、artemin(ARTN)和persephin(PSPN)组成。GDNF家族的各个 成员均与锚定于与质膜结合的受体的糖基磷脂酰肌醇（GPI)结合。这一家族的受体被称 为⑶NF家族受体a(GFRa)。这一受体家族由四个不同的GFRa受体组成，GFRal-4。 ⑶NF优先与GFRa1结合、NRTN优先与GFRa2结合、ARTN优先与GFRa3结合和PSPN优 先与GFRa4结合。各GDNF家族配体均通过RET( "在转染期间被重排的"）受体酪氨酸激 酶传递信号，RET受体酪氨酸激酶是首个发现的原癌基因。仅当所述配体先与其GFRa受 体结合的条件下RET才能够被⑶NF家族成员活化（Airaksinen，M.S.等，NatureReviews Neuroscience(2002)，3:383-394) 〇
[0004]ARTN和GFRa3均在发育过程中高表达并且其参与交感神经系统的发育。在成人 中，GFRa3的表达主要局限于背根神经节（DRG)的感受神经元（Orozco,O.E.等，European J.Neuroscience, (2001)，13:2177-2182)。在成年小鼠中，artemin在睾丸、子宫、甲状腺、 前列腺和附睾以及在嗅球和肠道和肠系膜的小动脉中表达（Airaksinen，M.S.等，Nature ReviewsNeuroscience(2002), 3:383-394 ；Airaksinen,M.S.等，Brain,Behaviorand Evolution, (2006) ,68:181-190)。
[0005] 已在若干研宄中显示了GFRa3和artemin在痛觉过敏中可能的作用。例如，已 证实将artemin蛋白注射进入嗤齿动物的后爪会引起热痛觉过敏，当artemin与NGF共同 注射时这一伤害感受增强（Malin，S.A?等，J.Neuroscience, (2006) ,26 (33): 8588-8599)。 其他研宄显示在小鼠炎症模型中arteminmRNA的表达上调（Elitt，C.M.等，J.Neuro science, (2006)，26(33) :8578-8587)。而且，其他研宄显示artemin转基因小鼠TRPV1 和TRPA1的表达增加并且其对冷和热的行为敏感性增加（Elitt，C.M.等，J.Neuroscien ce, (2006)，26 (33) : 8578-8587)。此外，已通过在GFRa3敲除小鼠中的研宄显示了GFRa3 在内脏高敏感性中可能的作用，在使用TNBS(2, 4, 6-三硝基苯磺酸）灌肠处理后与野生 型C57BL/6小鼠相比这些小鼠显示出内脏高敏感性的降低（Tanaka,T.等，Am.J.Physiol. Gastrointest.LiverPhysiol. (2011)，300:G418-G424)。还通过一项在接受了膜头切除的 患者中进行的研宄显示了artemin及其受体GFRa3在与胰腺炎相关的疼痛中可能的作用 (Ceyhan，G. 0?等，Gut, (2007)，56:534-544)。基于上述情况，获准进行进一步的研宄，以确 定使用GFRa3活性抑制剂的治疗是否对患有疼痛/痛觉过敏和/或高敏感性的患者可能 是有益的。
[0006] 在US6, 861，509中描述了结合GFRa3的抗体。此外，US6, 677, 135中披露了全长 的GFRa3 序列，而在US7,026, 138、US2007/0232535 和US2006/0216289 中描述了GFRa3 分子的剪接变体。US7, 138, 251中披露了与全长的GFRa3具有99%-致性的序列并且在 这篇专利中描述了针对这一分子的人源化单克隆抗体的制备。
[0007] 发明简沐
[0008] 在第一个方面，本发明提供了全人源单克隆抗体（mAb)及其抗原结合片段，所述 全人源单克隆抗体及其抗原结合片段与人GFRa3结合并抑制或阻断其活性，例如阻断 GFRa3与胶质细胞系来源的神经营养因子artemin的结合，并且可能阻断RET受体酪氨酸 激酶随后的活化和/或阻断通过RET介导的信号和/或阻断通过RET以外的其他介质介导 的信号。所述抗体或其抗原结合片段可以用于治疗针对任意感官刺激导致的痛觉过敏、异 常疼痛和/或高敏感性，包括但不限于压力、热和/或冷。所述抗体还可以用于治疗与广泛 的状况和病症相关的疼痛/高敏感性，在所述状况和病症中需要阻断GFRa3与artemin的 相互作用。所述抗体还可以用于抑制肿瘤细胞生长、增殖和/或转移。
[0009] 在一个实施方式中，本发明提供了一种分离的抗体或其抗原结合片段，所述抗体 或其抗原结合片段特异性地与人GFRa3结合并且具有一个或多个下述特征：
[0010] ⑴通过表面等离子体共振测定显示出的Kd范围为约10,至约1(T13M;
[0011] (ii)显示出将GFRa3与其配体artemin的结合阻断约50-100%的能力，其IC5Q 值范围为约40pM至约15nM;
[0012] (iii)显示出将GFRa3与使用artemin和RET的混合物涂覆的固体支持物的结合 阻断约20 %至约100%的能力；
[0013] (iv)阻断或抑制artemin依赖性RET的活化，其IC5Q范围为约200pM至约50nM ;
[0014] (v)在骨癌疼痛体内模型中抑制或减轻一种或多种疼痛感受性反应；
[0015] (vi)在体内抑制或减轻artemin敏感性热痛觉过敏；
[0016] (vii)在骨关节炎体内模型中抑制或减轻触诱发痛；
[0017] (viii)不与RET的其他GFR共受体发生交叉反应；
[0018] (ix)包含重链可变区（HCVR)，所述重链可变区具有选自下组的氨基酸序列：SEQ IDN0 :2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、 306、322、338、354、381和 397;或
[0019] (x)包含轻链可变区（LCVR)，所述轻链可变区具有选自下组的氨基酸序列：SEQID NO:10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、 330、346、362、389 和 405。
[0020] 在一个实施方式中，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段选自下组：鼠源性 抗体、嵌合抗体、人源化抗体和人源抗体。
[0021] 在一个实施方式中，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段不与人GFRa 1或 人GFRa 2发生交叉反应。
[0022] 在一个实施方式中，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含（a)重链可变 区（HCVR)，所述重链可变区具有选自下组的氨基酸序列：SEQIDN0:2、18、34、50、66、82、 98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322、338、354、381 和 397 以及（b)轻链可变区（LCVR)，所述轻链可变区具有选自下组的氨基酸序列：SEQIDN0:10、 26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、 346、362、389 和 405。
[0023] 在一个实施方式中，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段显示出将人GFRa3 与其配体3竹6!^11的结合阻断约50-95%的能力，其1(：5(|值范围为约4(^11至约75(^1。
[0024] 在一个实施方式中，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段将人GFRa3与其 配体artemin的结合阻断约75-100%，其IC5(I值范围为约400pM至约15nM。
[0025] 在一个实施方式中，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段阻断或抑制 artemin依赖性人RET的活化，其IC5(I范围为约300pM至约5nM。
[0026] 在一个实施方式中，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段阻断或抑制 artemin依赖性猕猴RET的活化，其IC5(I范围为约0. 7nM至约2. 5nM。
[0027] 在一个实施方式中，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含三个重链 CDR(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，所述重链CDR包含在选自下组的HCVR氨基酸序列中：SEQID NO:2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、 322、338、354、381 和 397 ;和三个轻链CDR(LCDR1、LCDR2 和LCDR3)，所述轻链CDR包含在 选自下组的LCVR氨基酸序列中：SEQIDN0:10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、 186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、346、362、389 和 405。
[0028] 在一个实施方式中，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链可变区 01〇^)，所述重链可变区具有选自下组的氨基酸序列 ：5￡0 10勵：2、18、34、50、66、82、98、 114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322、338、354、381 和 397。
[0029] 在一个实施方式中，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区 (LCVR)，所述轻链可变区具有选自下组的氨基酸序列：SEQIDN0:10、26、42、58、74、90、 106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、346、362、389 和 405 〇
[0030] 在一个实施方式中，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含选自下组的 HCVR/LCVR氨基酸序列对：SEQIDN0 :2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、 114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、 258/266、274/282、290/298、306/314、322/330、338/346、354/362、381/389 和 397/405。
[0031] 在一个实施方式中，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含选自下组的 HCVR/LCVR氨基酸序列对：SEQIDN0 :50/58、146/154、210/218 和 290/298。
[0032] 在一个实施方式中，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含：
[0033] (a)HCDRl结构域，所述HCDR1结构域具有选自下组的氨基酸序列：SEQIDN0 :4、 20、36、52、68、84、100、116、132、148、164、180、196、212、228、244、260、276、292、308、324、 340、356、383 和 399 ;
[0034] (b)HCDR2结构域，所述HCDR2结构域具有选自下组的氨基酸序列：SEQIDN0 :6、 22、38、54、70、86、102、118、134、150、166、182、198、214、230、246、262、278、294、310、326、 342、358、385 和 401 ;
[0035] (c)HCDR3结构域，所述HCDR3结构域具有选自下组的氨基酸序列：SEQIDN0 :8、 24、40、56、72、88、104、120、136、152、168、184、200、216、232、248、264、280、296、312、328、 344、360、387 和 403 ;
[0036] (d)LCDRl结构域，所述LCDR1结构域具有选自下组的氨基酸序列：SEQIDN0 :12、 28、44、60、76、92、108、124、140、156、172、188、204、220、236、252、268、284、300、316、332、 348、364、391和 407 ;
[0037] (e)LCDR2结构域，所述LCDR2结构域具有选自下组的氨基酸序列：SEQIDNO:14、 30、46、62、78、94、110、126、142、158、174、190、206、222、238、254、270、286、302、318、334、 350、366、393 和 409 ;以及
[0038] (f)LCDR3结构域，所述LCDR3结构域具有选自下组的氨基酸序列：SEQIDN0 :16、 32、48、64、80、96、112、128、144、160、176、192、208、224、240、256、272、288、304、320、336、 352、368、395 和 411。
[0039] 在一个实施方式中，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段与包含选自下组 的重链和轻链序列对的抗体或抗原结合片段竞争与人GFRa3的特异性结合：SEQIDN0 : 2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、 178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298、306/314、 322/330、338/346、354/362、381/389 和 397/405。
[0040] 在一个实施方式中，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段结合的人GFRa3 上的表位与被包含选自下组的重链和轻链序列对的抗体所识别的相同：SEQIDNO:2/10、 18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、 194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298、306/314、322/330、 338/346、354/362、381/389 和 397/405。
[0041] 本发明的抗体可以是全长的（例如，IgGl或IgG4抗体）或者可以仅包含抗原结 合部分（例如，Fab、F(ab'）2或scFv片段），并且可以进行修饰以影响其功能，例如消除残 余的效应器功能（Reddy等，2000,J.Immunol. 164:1925-1933)。
[0042] 在一个实施方式中，与人GFRa3特异性地结合的所述分离的抗体或其抗原结合 片段包含HVCR，所述HCVR包含三个重链CDR(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，所述重链CDR包含 在选自下组的HCVR氨基酸序列中：SEQIDN0:2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、 178、194、210、226、242、258、274、290、306、322、338、354、381和 397;和/或1〇^，所述1〇^ 包含三个轻链⑶R(IXDR1、IXDR2和IXDR3)，所述轻链⑶R包含在选自下组的LCVR氨基酸 序列中：SEQIDN0:10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、 266、282、298、314、330、346、362、389 和 405。用于标识HCVR和LCVR氨基酸序列中的CDR 的方法和技术是本领域公知的，并且其能够用于标识本申请中公开的特定HCVR和/或LCVR 氨基酸序列中的CDR。能够用于标识CDR边界的示例性的常规方法包括例如Kabat定义、 Chothia定义和AbM定义。一般而言，Kabat定义基于序列的变异性，Chothia定义基于 结构环区域的位置，而Abm定义是介于Kabat和Chothia方法之间的折中方法。参见例 如Kabat,"SequencesofProteinsofImmunologicalInterest(免疫学关注的蛋白序 列）"，NationalInstitutesofHealth,Bethesda，Md. (1991) ;Al_Lazikani等，J.Mol. Biol. 273:927-948 (1997)和Martin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:9268-9272 (1989)。 也可以利用公共数据库来鉴定抗体中CDR序列。
[0043] 在一个实施方式中，与人GFRa3特异性结合的所述分离的抗体或抗原结合片段 包含：
[0044] (a)HCDR3结构域，所述HCDR3结构域具有选自下组的氨基酸序列：SEQIDN0 :8、 24、40、56、72、88、104、120、136、152、168、184、200、216、232、248、264、280、296、312、328、 344、360、387 和 403 ;以及
[0045] (b)LCDR3结构域，所述LCDR3结构域具有选自下组的氨基酸序列：SEQIDNO: 16、 32、48、64、80、96、112、128、144、160、176、192、208、224、240、256、272、288、304、320、336、 352、368、395 和 411。
[0046] 在一个实施方式中，如上述（a)和（b)中所描述的与人GFRa3特异性结合的所述 分离的抗体或抗原结合片段还包含：
[0047] (c)HCDRl结构域，所述HCDR1结构域具有选自下组的氨基酸序列：SEQIDN0 :4、 20、36、52、68、84、100、116、132、148、164、180、196、212、228、244、260、276、292、308、324、 340、356、383 和 399 ;
[0048] (d)HCDR2结构域，所述HCDR2结构域具有选自下组的氨基酸序列：SEQIDN0:6、 22、38、54、70、86、102、118、134、150、166、182、198、214、230、246、262、278、294、310、326、 342、358、385 和 401 ;
[0049] (e)LCDRl结构域，所述LCDR1结构域具有选自下组的氨基酸序列：SEQIDN0 :12、 28、44、60、76、92、108、124、140、156、172、188、204、220、236、252、268、284、300、316、332、 348、364、391 和 407 ;以及
[0050] (f)LCDR2结构域，所述LCDR2结构域具有选自下组的氨基酸序列：SEQIDN0 :14、 30、46、62、78、94、110、126、142、158、174、190、206、222、238、254、270、286、302、318、334、 350、366、393 和 409。
[0051] 在一个实施方式中，本发明提供了一种全人源单克隆抗体或其抗原结合片段，所 述抗体或其抗原结合片段与人GFRa3特异性地结合，其中所述抗体或其片段显示出一个 或多个下述特征：（i)包含HCVR，所述HCVR具有选自下组的氨基酸序列：SEQIDN0:2、18、 34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322、338、 354、381和397;(ii)包含LCVR，所述LCVR具有选自下组的氨基酸序列：SEQIDN0:10、26、 42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、346、 362、389和405 ;(iii)HCDR3结构域，所述HCDR3结构域具有选自下组的氨基酸序列：SEQID NO:8、24、40、56、72、88、104、120、136、152、168、184、200、216、232、248、264、280、296、312、 328、344、360、387和403，或者与其具有至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%的序 列一致性的基本上相似的序列；和LCDR3结构域，所述LCDR3结构域具有选自下组的氨基酸 序列：SEQIDN0:16、32、48、64、80、96、112、128、144、160、176、192、208、224、240、256、272、 288、304、320、336、352、368、395和411，或者与其具有至少90%、至少95%、至少98%、或至 少99%的序列一致性的基本上相似的序列；（iv)HCDR1结构域，所述HCDR1结构域具有选自 下组的氨基酸序列：SEQIDN0:4、20、36、52、68、84、100、116、132、148、164、180、196、212、 228、244、260、276、292、308、324、340、356、383 和 399,或者与其具有至少 90%、至少 95%、 至少98 %、或至少99 %的序列一致性的基本上相似的序列；HCDR2结构域，所述HCDR2结 构域具有选自下组的氨基酸序列：SEQIDN0:6、22、38、54、70、86、102、118、134、150、166、 182、198、214、230、246、262、278、294、310、326、342、358、385 和 401，或者与其具有至少 90 %、至少95 %、至少98 %、或至少99 %的序列一致性的基本上相似的序列；IXDR1结构域， 所述LCDR1结构域具有选自下组的氨基酸序列：SEQIDN0:12、28、44、60、76、92、108、124、 140、156、172、188、204、220、236、252、268、284、300、316、332、348、364、391 和 407,或者与 其具有至少90 %、至少95 %、至少98 %、或至少99 %的序列一致性的基本上相似的序列； 以及LCDR2结构域，所述LCDR2结构域具有选自下组的氨基酸序列：SEQIDN0:14、30、46、 62、78、94、110、126、142、158、174、190、206、222、238、254、270、286、302、318、334、350、366、 393和409,或者与其具有至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%的序列一致性的基 本上相似的序列；(v)通过表面等离子体共振测定显示出的Kd范围为约1(T8M至约1(T13M; (vi)显示出将GFRa3与其配体artemin的结合阻断约50-100%的能力，其IC5(I值范围为 约40pM至约15nM; (vii)显示出将GFRa3与使用artemin和RET的混合物涂覆的固体支 持物的结合阻断约20%至约100%的能力；（viii)阻断或抑制artemin依赖性RET的活化， 其IC5Q范围为约200pM至约50nM;(ix)在骨癌疼痛体内模型中抑制或减轻一种或多种疼痛 感受性反应；(x)在体内抑制或减轻artemin敏感性热痛觉过敏；(xi)在骨关节炎体内模 型中抑制或减轻触诱发痛；（xii)不与RET的其他GFR共受体发生交叉反应。
[0052] 在一个实施方式中，本发明提供了一种抗体或抗体的抗原结合片段，所述抗体或 抗体的抗原结合片段包含HCDR3结构域，所述HCDR3结构域具有选自表1中所示的那些氨 基酸序列中的任意序列，或者与其具有至少90 %、至少95 %、至少98 %、或至少99 %的序列 一致性的基本上相似的序列；和LCDR3结构域，所述LCDR3结构域具有选自表1中所示那些 氨基酸序列中的任意序列，或者与