超稳定免疫球蛋白可变结构域的筛选和改造方法及其应用

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超稳定免疫球蛋白可变结构域的筛选和改造方法及其应用
【技术领域】
[0001] 以下公开涉及被称作Tat相关蛋白质改造工程(TAPE)的方法,通过将靶蛋白和抗 生素抗性蛋白融合到Tat信号序列并在大肠杆菌内表达它,筛选具有更高的溶解性和优异 的热稳定性的靶蛋白,特别是源自人种系的免疫球蛋白可变结构域(VH或VL)。本发明还涉 及由TAPE法筛选的、具有优异的溶解性和热稳定性的、人重链可变结构域抗体(下文称为 "VH结构域抗体")和轻链可变结构域抗体(下文称为"VL结构域抗体")和人或改造的VH 和VL结构域抗体支架。此外,以下公开内容涉及VH和VL结构域抗体和抗体支架的氨基酸 序列,以及编码所述氨基酸序列的多核苷酸。
[0002] 在含有根据本发明筛选的人或改造的VH或VL支架的VH或VL结构域抗体具有相 应的人或改造的VH或VL结构域抗体支架(不管CDR序列)的情况下,它仍保留溶解性和 热稳定性。
[0003] 此外,以下公开内容涉及在由TAPE法筛选的人或改造的VH或VL结构域抗体支架 中包括随机CDR序列的文库,以及其制备方法。
[0004] 此外,以下公开内容涉及使用所述文库筛选的、对靶蛋白质具有结合能力的VH或 VL结构域抗体,所述结构域抗体的氨基酸序列,编码所述氨基酸序列的多核苷酸。
[0005] 发明背景
[0006] 片段化的小尺寸抗体因为它与全长单克隆抗体(mAb)的不同理化性质而是一种 能够克服现有抗体疗法的局限性的有前途的抗体。存在单链抗体(scFv)、Fab(片段抗体结 合)抗体、免疫球蛋白可变结构域抗体,例如VH或VL等作为一般抗体片段,以及串联scFv、 双抗体、微型抗体等作为其修饰形式(Betteretal.,Science1988 240 (4855): 1041-3; Hustonetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 1988 85 (16) : 5879-83;Birdetal.,Science 1988 242(4877) : 423-6;Peietal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 1997 94 (18) : 9637-42 ; Iliadesetal.,FEBSLett. 1997 409 (3) :437-41;ffardetal.,Nature1989 341(6242):544-6)〇
[0007] 抗体片段或小尺寸的抗体与全长单克隆抗体相比主要是丧失了Fc(可结晶片段) 的功能,因此,没有由于Fc的存在而产生的预期效果,如,增加的循环半衰期、效应子功能 等。
[0008] 然而,小尺寸的片段化抗体被放大作为能够克服由于现有完整抗体的 大尺寸造成的局限下一代抗体,所述局限例如对结构上隐藏的表位的可及性、 药物渗透和生物分布、形式灵活性、高生产成本等(Zhao et al.,Blood 2007 110 (7):2569-77 ;Holliger et al.,Nat.Biotechnol.2005 23 (9):1126-36 ;Hudson et al.,Med. Microbiol. Immunol. 2009 198(3):157-74 ;Enever et al.,Curr. Opin. Biotechnol. 200920(4):405-ll)。
[0009] 此外,各种抗体片段和小尺寸抗体的优点在于可以通过化学方法或重组蛋白融合 的方法进行连接来实现双重或多重特异性。
[0010] 近来,这种优点已被用来引入多特异性,使得Fc功能被模块化,从而补充了已被 指出作为缺点的效应子功能和短的循环半衰期。例如,将对人血清白蛋白具有结合特异性 的片段或小尺寸抗体引入模块中以实现双特异性抗体,从而提高了循环半衰期,或将对免 疫细胞,如自然杀伤或T细胞具有特异亲合力的小尺寸抗体引入模块中,从而赋予它细胞 杀伤功能(Elsetal.,JBiolChem. 2001 9 ;276 (10): 7346-50;Bargouetal.,Science 2008 321 (5891): 974-7;etal.,Mol.CancerTher. 20087 (8): 2288-97)。另外,由于单个抗 体可以被设计成向预期具有不同作用模式的两个或更多个分子靶标赋予特异性,开启了显 著改善抗体的效力和经济可行性的可能性。
[0011] 人抗体结构中具有抗原特异性结合功能的最小单元是重链可变结构域(VH)或轻 链可变结构域(VL),这是定位在轻链或重链N-末端的可变结构域。由于各自两个N-末端 已进化成具有互补结构,在从血浆B细胞生产单克隆抗体时组装重链和轻链过程中,VH和 VL构成非共价结合型复合体,从而保持其结构的稳定性。人抗体可变结构域VH节段根据在 框架部分的氨基酸序列的同源性被分为7个家族(VH1、VH2、VH3、VH4、VH5、VH6、VH7),但不 包括CDR(互补决定区)结合表位,每个家族中含有3至22种不同的氨基酸序列。轻链的 VL分为Vk和VA,Vk分为六个家族而VA分为10个家族(〇1〇1:1113 6丨31.,1992]\]/[01. Biol.227, 799-917;Tomlinsonetal.,1995EMB0J. 14,4628-4638;ffilliamsetal. ,J. Mol.Biol. 264, 220-232)。人们已经知道,一些VH和VL根据相互亲和力的程度而具有优选 的VH/VL配对组合,并且因此,已经知晓基因的这种组合重排在扩大抗体库的多样性中起 重要作用(Ruudetal.,J.Mol.Biol. 1999, 285, 895-901)。
[0012] 根据6个⑶R的组合,结合型的VH/VL向特定抗原赋予互补结合特异性。轻 链的⑶R1、⑶R2和⑶R3和重链的⑶R1、⑶R2和⑶R3,共有6个⑶R,参与抗原的结 合。根据人类种系序列的分析,发现各种各自的CDR大多依赖于重链可变结构域的 ⑶R3。因此,这一分析表明抗体的结合特异性主要取决于重链的⑶R3的可变性(J.Mol. Recogni. 2000, 13, 167-187)。
[0013] 与此不同,动物如骆驼和美洲驼以及具有软骨骨架的鱼如鲨鱼具有单重链结构 而没有轻链结构的抗体。因此,这些抗体的可变结构域仅包括单个重链可变结构域(对 于骆驼和鲨鱼分别是VHH和VNAK),并且公知的是这种抗体在抗原结合和中和功能方面不比 VH和VL同时参与抗原结合的人抗体差。除了在具有重链疾病的人类患者中,VH或VL单 独很少存在(Hendershotetal.,J.Cell.Biol. 1987 104(3):761-7;Prellietal.,J. Immunol. 1992 148(3) :949-52)。其原因是VH或VL在VH或VL单独分离时由于其结构互补 体而在结构上是不稳定的,并且因此,可能容易发生蛋白质聚集。已知的是这种蛋白质聚集 部分地是由主要在VH和VL界面处分布的疏水性氨基酸残基所造成的疏水性相互作用而引 起。不同于人抗体,在骆驼抗体的情况下,具有亲水性的氨基酸残基可以特别地定位在VH/ VL边界区域的表面上。具体地,在骆驼抗体的四个位点处的氨基酸(它们是特异地与人VH3 家族的那些不同的)被称为四分体。这些氨基酸位于Kabat编号系统的位置37、44、45和 47 处(Kabatetal.,1991J.Immunol. 147 (5) ,1709-1719)。在氛基酸序列中这种差异可以 解释单可变结构域抗体(VHH)的稳定性。有人试图通过将人可变结构域抗体中在四分体位 置的氨基酸替换为骆驼抗体(G44E/L45R/W47G)的亲水性氨基酸,产生改善的骆驼科抗体。
[0014] 结果是,从理化性质的角度讲它们的溶解性会有所改善(Coppieters etal.,ArthritisRheum. 2006 54 (6):1856-66;Dolketal.,Proteins. 2005 59(3) :555-64;Ewertetal. ,Biochem. 200241 (11) :3628-36;Korttetal.,J.Protein Chem. 199514 (3): 167-78;Martinetal.,ProteinEng. 1997 10 (5): 607-14)。然而,与 骆驼抗体相比难以得到它们的稳定性,例如,降低的蛋白质表达产率和热稳定性Oavies etal.,FEBSLett.1994Feb21 ;339 (3) :285-90;Airesetal. ,J.Mol.Biol.2004 340 (3) : 525-42)。业已发现,其理由是,在VH/VL边界区域的氨基酸修饰会导致相应区域的 0-折叠结构的修饰(Riechmannetal.,J.Mol.Biol.l996 259(5):957-69)。与人抗体 相比较,骆驼单结构域抗体的CDR3具有异常长的环结构。根据结构分析发现,这种环结构 折叠成人抗体的VH/VL边界区域,并且已经提出,这种独特的结构部分地遮蔽了位于边界 区域中的疏水补丁,从而帮助稳定骆蛇单结构域抗体(Joostetal.,2010DrugDiscovery Today:Technologies7 (2), 139-14)〇
[0015] 在人类抗体中由于CDR3的相对较短的环结构而难以预期该屏蔽作用。总之,与骆 驼单结构域抗体相比,人单可变结构域本身有缺陷的理化性质,由此不足以被用作特定抗 原的结合配体的支架。作为克服这一点的方法,仅仅替换作为骆驼抗体的结构特征的四分 体氨基酸是不够的,进一步需要蛋白质结构设计和VH或VL的定向进化。
[0016] 存在于自然界的人免疫球蛋白可变结构域(VH或VL)是能够维持抗原结合特性的 最小尺寸的抗体(单克隆抗体大小的1/12),因此,预计与常规的单克隆抗体在物理性质和 作为治疗性蛋白质的治疗效果方面不同。因此,开发仅具有一个可变结构域的人抗体的需 求也增加了。然而,当VH或VL单独存在时,蛋白质的聚集和不稳定倾向仍然是主要障碍, 应该在开发特定抗原的结合支架时被克服。
[0017]因此,为了使抗体片段和小尺寸抗体提供一般的单克隆抗体不能实现的优点并保 持本身的竞争力,确保物质本身的稳健的药物和理
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