改良型人凝血因子FVII-Fc融合蛋白及其制备方法与用图
【专利说明】改良型人凝血因子FVI l-Fc融合蛋白及其制备方法与用途
[0001] 本发明为分案申请，其原申请的申请号为201310357373.X，申请日为2013年8月 16日，发明名称为"改良型人凝血因子FVII-化融合蛋白及其制备方法与用途"。
技术领域
[0002] 本发明设及一种改良型人凝血因子FVII的化融合蛋白及其制备方法和用途，特 别是治疗多种凝血相关疾病的用途。
【背景技术】
[0003] 凝血是由多种血液组分(或因子）之间复杂的相互作用组成的逐渐导致纤维蛋白 凝块形成的过程，通常参与被称为凝血"级联反应"的血液组分是原酶或酶原，即不具有酶 活性的蛋白，在激活剂的作用下使其转变为活性酶。凝血因子FVII就是该些凝血因子中的 一种。
[0004] FVII是一种维生素K依赖性的血浆糖蛋白，在肝脏中合成，并W分子量约为53 邸a的单链蛋白酶原形式分泌到血液中（化oze等，/公如7。細?，1980，255: 1242-1247)。 FVII酶原在单一位点Argl52-Ilel53处被蛋白酶水解，产生由一个二硫键连接的双链，从 而转变为其活性形式FVIIa。单链凝血因子FVII可W通过凝血因子巧a、凝血因子巧Ila 、凝血因子FIXa、凝血因子FVIIa或凝血酶在体外水解转化为双链凝血因子FVIIa。活化的 FVIIa包含N&-末端衍生的轻链(~20邸a)和C00H-末端衍生的经由单一二硫键（切S135 至切S262)连接的重链（~30KDa)。轻链含有细胞膜结合性Gla结构域和两个EGF结合结 构域，而重链含有催化结构域。处于活化形式时，FVIIa作为丝氨酸蛋白酶，参与凝血级联 反应的外源性途径（extrinsicpathway)。当血管的脉管内腔受损伤时，外源性凝血路径被 启动，细胞膜糖蛋白组织因子（TissueFactor,TF)被暴露，结合循环性的FVII和已存在 的较小量活化FVIIa,该种结合促进FVII全部转化为FVIIa,随后在巧离子和磯脂的协同作 用下，使FIX转化为FIXaJX转化为巧a,继而进一步将凝血酶原转化为凝血酶。凝血酶在 血液凝固和伤口愈合方面起关键作用，在血管损伤的最初阶段，其诱导血小板聚集并诱导 纤维蛋白形成，之后刺激细胞生长从而促进受损血管的修复（Osterud等，化(9C化 5bi必剧，1977，74: 5260-5264)。
[0005] 编码人FVII化FVII)的基因位于13号染色体的q34-qter9, 9个外显子组成，长 度为 12. 8 肺（0,Kara等，#別7 5bi似4 1987，84: 5158-5162)。hFVII包 含四个结构域：氨基端丫-駿基谷氨酸（Gla)结构域，两个"类表皮生长因子（EGF)"结构 域和駿基端丝氨酸蛋白酶域(催化结构域)。外显子la和Ib编码信号肤序列；外显子2编 码Gla结构域；外显子3编码一段短的疏水区；外显子4和5编码类表皮生长因子结构域； 外显子6至8编码丝氨酸蛋白酶催化结构域（Yoshitake等，公化7, 1985, 24: 3736-3750)。成熟FVII蛋白经历多种翻译后修饰，包括维生素K依赖性的駿基化，导致该 分子N肥-末端产生10个丫駿基化的谷氨酸残基。其他翻译后修饰包括哲基化（Asp63)、 N-型糖基化（Asnl45和Asn322)W及0-型糖基化（Ser52和Ser60)。
[0006] 血友病A和B是遗传性疾病，分别是凝血因子FVIII和凝血因子FIX的缺陷而 造成的。蛋白替代疗法是血友病A和B的传统治疗方法，包括静脉内给予从人血浆中制备 的或基因工程方法获得的重组FVIII或FIX。然而，在血友病A和B的治疗中，存在最严重 的医学问题是针对替代凝血因子的同种抗体（alloantibody)的产生，该导致治疗效力降低 或者使治疗无效。所有血友病A患者中产生针对凝血因子FVIII抗体高达30%，而针对血 友病B产生凝血因子FIX抗体发生几率较小，但具有更严重的后果，因为它们对免疫耐受性 诱导疗法较不敏感。在血友病治疗中使用FVIIa是基于FVIIa对于凝血酶活化的血小板 表面的低亲和性结合，通过给予药物学剂量的外源性FVIIa，使损伤位处血小板表面上的凝 血酶产生被增强，该与FVIII/FIX的存在无关，即绕开对于凝血因子Villa和凝血因子IXa 的需求来达到止血。因此，FVIIa可用于存在有抑制物的血友病患者的出血性状况的治疗。 FVIIa还被用于治疗先天性FVII缺陷的患者。另外，FVIIa越来越多地被用做适应症外使 用（off-lableuse),如治疗与非血友病患者中先天性或获得性出血性疾病，外伤或手术相 关的出血。
[0007] 鉴于血浆FVII的来源有限，且伴有病毒感染的风险。重组FVII已成为研发重点 之一。有报道FVII在BHK细胞或其它哺乳动物细胞中的有效表达（W09215686，W09111514， W08810295 )，并在纯化过程中将其转变成活化的FVIIa。专利FR0604872还描述了利用 转基因动物制备FVIIa的方法。市售的重组凝血因子FVIIa目前只有NovoSeven? (Novo Nordisk，丹麦)。该药已在全世界范围内被批准用于治疗具有因产生FVIII或FIX抗体(抑 制剂）的血友病A或B患者，先天性FVII缺陷的患者和终止与外伤和/或手术相关的出血 事件或预防出血。
[0008] 治疗性凝血蛋白药物包括FVIIa在内会被蛋白水解酶快速降解，并且易被抗体中 和，该会降低它们的半衰期和体内循环时间，由此限制了它们的疗效。在"SummaryBasis forApprovalNovoSeven?"(抑A参考号96-0597)中报道了重组FVIIa在人体内循环半衰 期为2. 3小时，而相对高的剂量和频繁给药对于达到并维持期望的疗效和预防效果是必须 的，该导致极高的治疗成本W及患者治疗的不便。迄今，还没有商品化的具有延长血浆半衰 期的重组FVIIa。由于凝血因子FVII/VIIa具有作为通用止血剂的潜能，因此仍然存在开 发具有更长的体内功能半衰期（化nctionalhalf-life)FVII的临床需求。目前有多种策 略应用于改善FVII药动学特性，延长其体内半衰期。如与脂类或PEG结合。NovoNordisk 公司正在开发的糖聚己醇二醇化FVIIa(参见专利US20050113565和US8053410)和PCT申 请W02008074032还提及一种具有延长体内半衰期的FVIIa-聚唾液酸结合物。此外，已公 开的其它方法还有增加糖基化位点，比如Bayer公司正在开发的高糖基化FVIIa,T106N和 V253N点突变（参见专利US20060252128、EP1549677B和US20100260741)或CSLBe虹ing 公司正在开发的FVIIa-白蛋白融合蛋白（参见专利W02007090584)。美国ProlorBiotech 公司正在开发的一种长效凝血因子FVII，将hCG的駿基肤（Carbo巧-terminal，CTP)连接至 凝血因子FVII的駿基端获得了具有延长半衰期的FVII(参见专利US20100317585)。
[0009]IgG类的免疫球蛋白是人类血液中最丰富的蛋白质。它们的半衰期可高达21 天，而Fc片段是IgG保持体内较长半衰期的主要原因，同时具有稳定蛋白的作用。大量 研究已证实IgG的Fc片段与活性蛋白连接构成融合蛋白，可W提高活性蛋白的体内半衰 期，该种方法已被用于一些临床上很重要的细胞因子巧日EPO-Fc，GCSF-Fc，IL2-FC，和 IFNa2a-Fc)和可溶性受体巧日TNFR-Fc,VEGFR-Fc,LFA3-化和CTLA4-FC)，化融合蛋白 在体内半衰期都有不同程度的延长（美国专利No. 5349053和6224867)。天然原型或改造 的双头同源二聚体化融合蛋白是通过IgG化绞链区中的半脱氨酸残基连接的形成类似于 IgG分子但无CH1区域和轻链。由于结构上的同源，化融合蛋白表现出与类似同亚型人IgG 相当的体外药物动力学特性，目前已经上市的化融合蛋白都是该种类型的。另外，Biogen Idee公司最近几年开发的单头二聚体化融合蛋白是化二聚体一端含有融合的目标蛋白， 另一端是不含任何目标蛋白的空白，该种方法主要针对W下两种情况；一是那些待表达的 目标蛋白的重组表达难度很高，双头同源二聚体化融合的正确折叠和分泌效率低；二是目 标分子很大，双头同源二聚体化融合可能产生=维结构的空间位阻而影响目标蛋白的功 能发挥。目前单头二聚体化融合方法已经应用于凝血因子FVIII、FIXW及FVII，W期实现 在C册细胞内的高效重组表达，同时具有延长的体内半衰期，其中单头二聚体FVIII-FcW 及FIX-化融合蛋白均已进入临床研究阶段，并分别在W02011069164A2和专利EP1624891B1 中进行了公开，而同时欧洲专利EP1624891B1也公开了单头二聚体FVII与化的融合形式。
[0010] 针对W上现有技术中所述有关同源二聚体化融合FVII的制备的困难及其在临 床应用过程中存在的局限，如表达量不高、半衰期短W及稳定性差等，本领域迫切需要开发 长效、稳定性好且可WW合理的成本生产的FVII衍生物。由于hFVII-L-v化融合蛋白的 构建有其本质上的困难，迄今为止尚没有获得具有半衰期显著延长且可稳定高效表