适于转化细胞的构建体、系统及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体地涉及适于转化细胞的构建体、系统及其应用，更 具体地，涉及两种配合使用的适于转化细胞的构建体、适于转化细胞的系统、转化细胞的方 法W及重组细胞。
【背景技术】
[0002] 规律成簇间隔短回文重复（ClusteredRegularlyInterspaced化ort Palin化omicRepeats,CRISPR)系统是一类广泛分布于细菌和古菌基因组中的重复结构， CRISPR含有一个与病毒或质粒同源的短重复序列，通过对外来同源的DNA作用影响病毒或 质粒的复制，是原核生物的免疫系统一部分。CRISH?重复间隔阵列可W被转录成一个长的 初级转录本，由于该序列包含多个重复片段，可形成多个发夹结构的二级结构，随后被加工 成一个个短的CRISPRRNAs，该些RNA序列包含一段保守的重复片段和一段与外源DNA互 补的可变间隔序列，也叫引导序列（guidesequence)。在CRISPR位点附近，存在一系列 CRISPR相关基因（CRISPR-associated,Cas)，crRNAs可W和Cas蛋白结合，将Cas蛋白引导 到祀序列周围，诱导双链切割功能，形成DNA双链断裂。依据核也元件组成和序列的差异， 可W将CRISPR/Cas系统分成3类。第I型和第III型CRISPR系统，涉及到多个亚基复合 体参与crRNA识别和双链切割。相比而言，第II型CRISPR系统仅包含单一的化s9蛋白， 参与crRNA介导的外源双链切割。
[000引在II型CRISPR系统中，crRNA可W通过碱基对来连接反式活性的RNA(tracr-RNA)来形成复合RNA结构。该种复合RNA结构分子可W指导化s9蛋白质来在特 定位点引入双链DNA的断裂。而化s9可W结合tracrRNA;crRNA复合物反过来通过指导其 来结合至DNA序列上发挥作用。在该个化s9 -crRNA复合物行使功能的过程中，短间区序 列邻近基序（protospacer-adjacentmotif，PAM)起着识别敌我的作用，在祀序列的周围具 有一些短特征序列，如NGG结构，是CAS9行使功能的重要前提。此外，tracrRNA;crRNA复 合体可W通过序列融合，形成融合转录本，且可W被化s9高效识别，该类融合RNA也叫引导 RNA(guideRNA，gRNAs)。因此，Cas9-gRNA系统中，包含与祀序列完全互补的20个碱基的 gRNA介导特异性识别，而化s9的2个截然不同的活性位点（RuvCandHNH)行使位点特异 性切割功能。
[0004]目前，CRISPR-化s9系统已应用于细菌、酵母、斑马鱼、小鼠W及人类细胞基因组修 饰等方面。但是，现有的CRISPR-化s9系统在细胞基因组修饰方面效率较低，不同实验室结 果差异较大；另外，细胞阳性克隆筛选常采用共转抗性表达载体或流式细胞筛选或单细胞 稀释接种，该些方法具有各自的缺陷，如共转抗性表达载体筛选获得单克隆细胞纯度低、抗 性基因的插入导致生物安全性问题，流式细胞筛选后细胞伤害较大，尤其对于原代细胞，单 细胞稀释接种流程繁琐、细胞接种密度低导致细胞生长受抑。该些不同不足的存在影响了 CRISPR-化s9系统的广泛、高效应用。
[0005] 因而，现阶段的CRISPR-化s9系统仍有待改进。
【发明内容】
[0006] 本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的 在于提出一种切割效率高、安全高效、重复性好、无标记基因修饰细胞的新型CRISPR-化s9 系统。
[0007] 根据本发明的一个方面，本发明提供了一种适于转化细胞的构建体。根据本发明 的实施例，该适于转化细胞的构建体包含编码化S9的核酸序列，且不包含筛选标记基因。 在本文中有时将该构建体称为"第一构建体"或"化s9表达载体"。此外，需要说明的是，在 本文中"构建体"和"载体"意义相同，可W互换使用。发明人惊奇地发现，将该适于转化细 胞的构建体与本发明下述的另一种适于转化细胞的构建体，即包含附着子序列、tracrRNA 序列和crRNA序列，其中所述tracrRNA序列与所述crRNA序列可操作地连接构成gRNAs表 达框的适于转化细胞的构建体配合使用，即利用该两种构建体共转染细胞，能够有效实现 对哺乳动物细胞的多种基因的剪切修饰，并获得无标记细胞株，且切割效率高、安全高效、 重复性好。
[0008] 根据本发明的又一方面，本发明还提供了另一种适于转化细胞的构建体。根据本 发明的实施例，该适于转化细胞的构建体包含；附着子序列、tracrRNA序列和crRNA序列， 其中所述tracrRNA序列与所述crRNA序列可操作地连接构成gRNAs表达框。在本文中有 时将该构建体称为"第二构建体"或"gRNA(附着子）表达载体"。将该适于转化细胞的构建 体与前述的本发明的另一种适于转化细胞的构建体，即包含编码化S9的核酸序列，且不包 含筛选标记基因的适于转化细胞的构建体配合使用，即利用该两种构建体共转染细胞，能 够有效实现对哺乳动物细胞的多种基因的剪切修饰，并获得无标记细胞株，且切割效率高、 安全高效、重复性好。
[0009] 根据本发明的再一方面，本发明还提供了一种适于转化细胞的系统。根据本发明 的实施例，该适于转化细胞的系统包括：第一构建体，所述第一构建体为前面所述的包含编 码化S9的核酸序列，且不包含筛选标记基因的适于转化细胞的构建体；W及第二构建体， 所述第二构建体为前面所述的包含附着子序列、tracrRNA序列和crRNA序列，其中所述 tracrRNA序列与所述crRNA序列可操作地连接构成gRNAs表达框的适于转化细胞的构建 体。利用该系统转化细胞，能够有效实现对哺乳动物细胞的多种基因的剪切修饰，并获得无 标记细胞株。并且，切割效率高、安全高效、重复性好。
[0010] 根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种转化细胞的方法。根据本发明的实 施例，该方法包括：利用前面所述的适于转化细胞的系统转化细胞。发明人惊奇地发现，利 用该方法转化细胞，能够有效实现对哺乳动物细胞的多种基因的剪切修饰，并获得无标记 细胞株。并且，切割效率高、安全高效、重复性好。
[0011] 根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种重组细胞。根据本发明的实施例，该 重组细胞是通过前面所述的方法获得的。该重组细胞的特异位点被剪切而发生突变，从而 能够作为疾病模型对于人类基因治疗领域意义重大，且能够有效用于家畜动物遗传改良。
[0012] 本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变 得明显，或通过本发明的实践了解到。
【附图说明】
[0013] 本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变 得明显和容易理解，其中：
[0014] 图1是根据本发明一个实施例的化s9构建载体电泳图，其中
[0015] 图1 (a)是化s9分别合成的3个片段载体酶切鉴定图，
[0016] 图1 (b)是完整化s9基因片段连接在T载体上的酶切鉴定图，
[0017] 图1(C)是化s9表达载体酶切鉴定图；
[0018] 图2是根据本发明的一个实施例的化s9表达载体结构示意图；
[0019] 图3是根据本发明的一个实施例