一种用于多种蛋白酶活性长时间实时并行检测的纳米探针的制作方法【
技术领域：
】[0001]本发明属于蛋白质检测领域，具体涉及一种基于能量转移的可用于活细胞内多种蛋白酶活性长时间实时并行检测的纳米探针。【
背景技术：
】[0002]蛋白质的发展史中，蛋白酶的研宄占极重要的地位，它来源丰富，容易提纯，分子量小，功能较简单。细胞生命周期的各个阶段都与蛋白酶紧密相关，例如在细胞的融合与分化以及大分子的装配等过程中，都有相应专一的蛋白酶参与，它们起着很重要的生物调控作用。目前，对蛋白质的一级结构至高级结构以及酶的作用机制的研宄一直处于生物医学领域的前沿。[0003]2005年，美国莱斯大学的Emmanue等开发了一种基于量子点和金颗粒的发光探针，能够用来测定蛋白水解酶的活性，遗憾的是，该检测并不能应用于活细胞的检测。(ChangE,MillerJS，SunJT,etal.Protease-activatedquantumdotprobes.B1chemicalandB1physicalResearchCommunicat1ns.2005,334:1317-1321.)2010年，Youngseon等人通过量子点和有机熄灭剂构成的荧光探针，检测了转染了HIV-1蛋白酶的活性，但该探针只检测了一种酶的活性，没有实现多种酶的并行检测。(ChoiY,LeeJ,KimK,etal.FluorogenicassayandlivecellimagingofHIV-1proteaseactivityusingacid-stablequantumdot—peptidecomplex.Chemicalcommunicat1ns.2010，46:9146-9148.)2012年，伯克利StuartB.Lowe等在ACSNano报道，在细胞外用基于能量转移的探针能同时检测serineprotease(丝氨酸蛋白酶)、tyrosinekinase(酪氨酸激酶)两种不同类型酶的活性，然而该检测过程是在细胞外进行的。(LoweSB,DickJAG,CohenBE,etal.MultiplexSensingofProteaseandKinaseEnzymeActivityviaOrthogonalCouplingofQuantumDotPeptideConjugates.ACSNan0.2012,6:851-857.)[0004]在活系统中，很多蛋白酶被表达为非活性的前体蛋白(酶原)，然后在控制下被蛋白水解裂解之后被激活。对于蛋白水解活性的其他控制来自于内源性抑制剂，所述内源性抑制剂与蛋白水解酶的催化活性形式结合并使之灭活。由于存在这种严格的控制，因此在细胞或生理学时间中研宄蛋白酶功能时需要检测蛋白酶活性而不只是检测蛋白酶的表达。目前蛋白酶的检测方法一般都需裂解细胞，将蛋白酶分离然后检测，不能够实时动态反映酶的变化；而能够检测单细胞内部酶的活性的现有方法并不能实现并行检测。同时目前基于荧光检测酶活性的成熟方法，采用荧光蛋白或有机染料，都面临荧光漂白的问题。荧光强度自身漂白很快，一方面会给检测结果带来很大误差，同时也不能够长时间检测。[0005]现阶段蛋白酶的活性检测主要集中在单一种类酶的活性检测，如研宄细胞凋亡主要集中在caspase家族上，而越来越多的文献报道，细胞中尤其是溶酶体中的其它蛋白酶也参与了细胞的凋亡过程，例如胰凝乳蛋白酶chymotrypsinB(CtrB)ο(ZhaoK,ZhaoX,TuY,etal.LysosomalchymotrypsinBpotentiatesapoptosisviacleavageofBid.CellularandMolecularLifeSciences.2010，67:2665-2678.)同时每种细胞中的蛋白酶的含量及活化时间也因细胞种类的不同而有所差异，即使是同一种细胞，不同细胞间的蛋白酶活性也不同。同一个细胞，在生命周期各个阶段不同的蛋白酶参与新陈代谢的情况也有差异，所以需要基于活细胞的多种蛋白酶并行检测手段。[0006]如果需要更加整体、准确地了解蛋白酶在细胞内部的表达、含量变化、物理空间位置变化，单独分析一种蛋白酶往往是不够的。细胞作为一个生命体，其中各种物质往往是同时发生作用，相互影响，相互调节。如caspase家族的蛋白，通常不是单独发生作用，而它们是何时发生作用的，又是以怎样的顺序发生作用的，这些问题的答案都是目前检测方法无法得到的。有些酶的活性只在细胞生理周期的某个阶段表现出来，而目前的检测方法也无法监测酶的这种瞬态活性变化。[0007]综上，实现长时间实时并行检测活细胞内多种蛋白酶的活性很有必要，也具有广泛的应用前景。【
发明内容】[0008]为克服目前不能并行检测活细胞内部蛋白酶的活性，且不能长时间实时监测蛋白酶活性变化的问题，本发明提供了一种用于多种蛋白酶活性长时间实时并行检测的纳米探针。[0009]—种用于多种蛋白酶活性长时间实时并行检测的纳米探针，利用量子点2和纳米金颗粒4分别作为供体和受体，通过底物多肽3连接量子点和纳米金颗粒形成能量转移供受体对，且用穿透肽I修饰供受体对，即形成以“穿透肽-量子点-底物多肽-纳米金颗粒”为结构的蛋白酶活性检测探针，如图1所示。该探针能高效率地进入活细胞，实现长时间对细胞内多种蛋白酶活性的并行检测。[0010]一种用于多种蛋白酶活性长时间实时并行检测的纳米探针，所述底物多肽3包含待测蛋白酶水解的位点，底物多肽3的结构为b1tin-GRRG-XXXX-GGRRC，其中b1tin代表用于偶联的生物素，头尾两端氨基酸序列GRRG-与-GGRRC均为D型氨基酸。由于能够被酶解的蛋白质、肽链的成分一般都为L型天然氨基酸，因此底物多肽3的非关键部分选用D型氨基酸，可以减少非特异性酶解。中间段未知氨基酸序列-XXXX-提供酶解位点，为L型天然氨基酸，具体的氨基酸序列根据待检测酶的特性决定。[0011]底物多肽3过长，供受体之间的能量转移效率将变低；而多肽过短，处于供受体两种纳米粒子之间的切割位点不容易被待检测蛋白酶接触，产生空间位阻效应。所述探针的底物多肽3的氨基酸长度适中，切割点的位置与两种纳米粒子的距离均合适，保证了较高的酶解效率和能量转移效率。[0012]所述的穿透肽I为细胞生长因子EGF，其一端用生物素修饰，以结合在量子点2表面。[0013]所述的量子点2具有通用性，种类不限，其表面用链霉亲和素修饰，与底物多肽3相连接。[0014]所述的纳米金颗粒4，直径范围为2nm-15nm。[0015]所述探针的最终结构为“穿透肽-量子点-底物多肽-纳米金颗粒”，如图1所示。当探针没有接触到待测蛋白酶时，用光源激发探针中包含的量子点2时，量子点吸收的光能不表现为光子的形式发射出去，而是通过电偶极的作用传递给受体纳米金颗粒4，如图2所示。当探针与待测蛋白酶接触后，底物多肽3会被待测蛋白酶切断，如图3所示，量子点2和纳米金颗粒4之间的距离增大，超出能产生能量转移的有效距离，此时用光源激发探针中包含的量子点2时，量子点恢复发光的特性。[0016]所述探针使用不同发射光谱的量子点2分别结合含有不同酶切位点的底物多肽3，可以得到检测不同蛋白酶的多种探针，每一种探针对应一种量子点荧光颜色、包含一种蛋白酶的酶切位点，即每一种探针和一种待测蛋白酶具有对应关系；当这些探针进入活细胞内部时，在同一种波段的激发光下通过不同的量子点荧光颜色分辨出探针的种类，实现多种蛋白酶的并行检测。[0017]本发明设计的探针的优点是:能够实现活细胞内多种蛋白酶活性的长时间实时并行检测，探针能高效率地进入细胞，且进入细胞的方式对细胞无伤害。此探针抗光漂白性能强，能长时间检测活细胞内蛋白酶活性，可达一个月。它能够反映出蛋白酶在细胞内的分布，并实时反映出各待测蛋白酶被激活的时间，以及待测蛋白酶在细胞中表现出活性的次序。所以本发明设计的探针，能够实时检测细胞内多种酶的活性，能够更加全面地了解细胞中酶的特性，以及各种酶之间的相互影响。【附图说明】[0018]图1:探针/」、意图ο[0019当前第1页1 2