一种基于高分辨率熔解曲线判定大肠杆菌对喹诺酮类药物耐药水平的分子检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种基于高分辨率烙解曲线判定大肠杆菌对嗟诺酬类药物耐药水平 的分子检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 嗟诺酬类药物自首次投入使用后，因广谱高效、抗菌机制独特而被广泛应用于医 学领域。不合理的使用及复杂的耐药机制，导致细菌对该类药物的耐药性问题日益严重，严 重制约其使用效果。因此对该类药物耐药问题的研究显得刻不容缓。然而目前判断细菌对 嗟诺酬类药物耐药水平的方法仍W传统的药敏实验为主，从样本采集到报告结果常需数天 时间，阻碍了人们及时合理地选择敏感药物。
[0003] 目前研究发现细菌对嗟诺酬类药物耐药的机制主要有S类；DNA拓扑异构酶II (回旋酶）与拓扑异构酶IV基因突变导致药物失去作用位点、质粒介导的细菌对嗟诺酬类药 物的抗性、细菌的主动外排机制。后两种机制主要与细菌的低浓度耐药有关，基因的突变和 高浓度耐药有关。DNA拓扑异构酶II和拓扑异构酶IV，在核酸合成中起调控DNA拓扑学状态 的作用。DNA拓扑异构酶II为Gyrase A和Gyrase B两个亚单位构成的异四聚体，可共同作 用将DNA正超螺旋的一条单链切开、移位、封闭，引入负超螺旋，在DNA复制中起重要作用。 拓扑异构酶IV主要功能是通过松弛DNA超螺旋、解除DNA结节和解环连体而发挥去除DNA 缠绕的作用，并对子代染色体的分离具有重要作用。嗟诺酬类药物通过结合旋转酶或拓扑 异构酶IV，影响酶的功能、阻断细菌DNA的复制而引起菌体死亡。拓扑异构酶II编码基因或 拓扑异构酶IV编码基因的点突变可能会影响药物和酶的结合而降低细菌对其敏感性。应用 常规PCR对细菌耐药机制进行研究，需要在扩增结束后对产物进行测序分析，费时较长。因 此亟需一种快速准确的方法鉴别大肠杆菌，且能快速判断其对嗟诺酬类药物的耐药水平。
【发明内容】
[0004] 嗟诺酬类药物被广泛应用于人类及动物疾病的治疗，但是细菌对该类药物耐药性 与日俱增，极大制约了此类药物的使用效果及应用范围。拓扑异构酶II编码基因或拓扑异 构酶IV编码基因的点突变可能会影响药物和酶的结合而降低细菌对其敏感性。研究发现大 肠杆菌临床分离株的6了356 ^基因突变居多且与细菌的高浓度耐药性有关。然而目前判 断该些突变位点的最主要方式仍是通过PCR扩增后进行核酸测序的手段。
[0005] 本发明提供了一种快速鉴定大肠杆菌及其耐药性水平的检测手段，可快速判断某 些对大肠杆菌耐嗟诺酬类药物影响显著的突变点。鉴于嗟诺酬类药物在医学领域的广泛应 用，本发明专利将会带来可观的经济效益，使用本发明的手段可快速、方便、有效地为合理 用药提供重要参考，并为耐药性研究提供技术支持。
[0006] 本发明提供了一种可快速、敏感、准确判断大肠杆菌对嗟诺酬类药物耐药水平的 检测试剂盒，本发明的试剂盒可特异性扩增大肠杆菌的核酸，而不扩增其它细菌、病毒、寄 生虫、植物、动物等的核酸，并且可应用于多种组织器官与物种来源的临床样本，无需细菌 分离纯化。
[0007] 本发明选择场rase遍j因作为目标基因，场rase遍j因的突变在大肠杆菌临床 分离株中居多，并与细菌的高浓度耐药性有关，其N端的高频突变区被认为是嗟诺酬类药 物耐药决定区（Q畑R，quinolone resistance-determining region)。本发明通过设ir|对 引物和探针，特异扩增所有大肠杆菌的核酸，PCR扩增产物包含QRDR区，探针结合区即在该 区高频突变点所在区域。探针结合区内碱基的错配会导致解链温度（rj变化，每种突变对 应特定的r。。因此，通过r。，即可区分不同的点突变类型，快速确定大肠杆菌对嗟诺酬类药 物的耐药水平。
[0008]本发明从GenBanKWWW.ncbi.nlm.nih.gov)获取场rase基因（NCBIReference Sequence:NZ_ASHD01000043. 1)的序列。
[0009] 本发明的技术方案是； 一种用于判定大肠杆菌对嗟诺酬类药物耐药水平的引物，包括上游引物和下游引物， 其核巧酸序列为： 上游引物；5，-ctttacgccatgaacgtactaggc-3， 下游引物；5, -tttccgtaccgtcatagttatcaac-3，。
[0010] 一种用于判定大肠杆菌对嗟诺酬类药物耐药水平的探针，包括探针-1和探针-2， 其核巧酸序列为： 探针-1:5'-ggggatggtatttaccgattacgtcaccaacgaca-6-FAM-3' 探针-2:5，-LCRED64〇-acgatcgtgtcataaaccgccgagtcacca-磯酸-3。
[0011] 一种判定大肠杆菌对嗟诺酬类药物耐药水平的分子检测试剂盒，包括上述的引 物，还包括上述的探针。
[0012] 所述的试剂盒还包括用上述引物进行PCR扩增的步骤。
[001引 PCR用的标准定量试剂；由IDT合成场rase^基因的核酸序列，此序列涵盖PCR的 扩增区域。依据合成物的分子量和绝对重量化及PicoGreen的DNA定量技术，计算合成物 所含的6了ase^基因的拷贝数。随后，对合成物进行稀释，制备每lOyl合成物的稀释试 剂含10000拷贝、1000拷贝、100拷贝、10拷贝目的基因，作为PCR的标准定量试剂； 待检样品的DNA模板；本发明所用的检测模板包括大肠杆菌的核酸、沙口菌核酸、寄生 虫核酸(球虫和弓形虫的核酸)、病毒核酸(禽流感病毒全核酸)、动物的核酸(犬全血核酸)。 PCR扩增体系为；20y1的扩增体系，包10y1的样品DNA模板或者定量标准试剂、IxPCR缓冲液、1uM上游引物-1、1uM下游引物、0. 2yM的6-FAM探针、0. 2yM的LCRed640 探针、2个单位的商业化Taq酶、200yMdNTP。 PCR扩增条件为；共 40 个循环，95°C10s，56°C15s, 72°C15So[0014] PCR扩增结束后进行高分辨率烙解曲线分析；将温度从45DC逐渐上升到 85°C，W每秒0. 11。C递增，持续监测巧光强度的变化，分析F4/F1，即640皿:530皿的 巧光强度的比值，F4/F1的第一衍生值-d(F4/F1)/化被读为该DNA的烙解温度。
[00巧]根据巧盧度判断点突变类型原理图解如图1所示；图1的上图中（A图），横坐标 表示温度，纵坐标表示巧光强度，曲线表示巧光强度同温度变化的关系；图1的下图（B图） 中，横坐标表示温度，纵坐标表示单位时间内巧光强度的变化同时间的比值，曲线表示该比 值同温度间的关系。PCR扩增结束后，对产物进行高分辨率的烙解曲线分析，温度从40°C逐 渐升高至85°C。探针逐渐同PCR产物分离，巧光强度下降。当巧光强度下降速度最快时，该 点的温度即为巧盧度。模板存在点突变时会导致探针与模板的碱基无法完全匹配，而使相 互结合的能力下降，rji之发生变化。
[0016] 本发明从五个方面保证6了ase^FRET-qPCR的特异性； 1) 本发明设计的引物和探针经过GenBank的BLAST捜索，确认本发明设计的引物能 特异地扩增大肠杆菌6了356如勺基因，而不扩增其它细菌、病毒、寄生虫、植物、动物的核酸 (在临床样本中，细菌的核酸常同该些核酸混合在一起)。同时，通过BLAST确认，一对上下 游引物和二个探针能特异地扩增和检测所有大肠杆菌6了ase^基因的核酸； 2) 本发明检测了来自不同物种(鸡、鸭、猪、牛)、不同组织及器官(肝、肺、肠、奶、精液） 临床样本的核酸； 3) 观察W上扩增对象在PCR过程中巧光强度（640nm)的变化，W及PCR扩增产物在琼 脂糖凝胶电泳的条带的大小。巧光在640nm波长出现或增强，显示阳性；PCR扩增产物在 琼脂糖凝胶电泳显示预期的316bp大小的条带； 4) 对扩增的PCR产物进行测序，测序的结果和GenBank的标准序列进行比对。
[0017] PCR灵敏度的确定； 由IDT合成6了^基因的代表序列。依据合成物的分子量和绝对重量W及PicoGreen的DNA定量技术，计算合成物所含基因拷贝的绝对数目。随后对合成物进行稀 释，制备每10y1合成物的稀释试剂含10000拷贝、1000拷贝、100拷贝、10拷贝的基因。用 本发明系统扩增含不同基因浓度的DNA模板，确定本发明检测此基因的灵敏度。结果显示， 本发明的反应系统可扩增10拷贝/体系浓度的模板，如图2所示。
[001引本发明建立了一套基于大肠杆菌拓扑异构酶II编码基因（(水rase^基因）的FRET-qPCR检测试剂盒，可直接应用于临床样本，无需细菌分离、纯化。该系统可高度敏感、 特异地扩增不同物种(鸡、鸭、牛、猪、）、组织器官(肝、肺、肠、奶、精液）来源大肠杆菌的核 酸，而不扩增其他细菌、病毒、寄生虫、植物、动物的核酸。本发明设计的扩增片段包含一段 嗟诺酬类药物耐药决定区（QRDR)。拓扑异构酶编码基因上的点突变可能会改变酶的性状而 影响药物和酶的结合，从