与红麻细胞质不育相关的snp分子标记及其扩增引物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物检测领域，具体地说，设及与红麻细胞质不育相关的SNP分子标 记及其扩增引物。
【背景技术】
[0002]红麻化ibiscyScann油inySL.)是锦葵科（Malvaceae)木穫属化ibiscyS) 一年生草本初皮纤维作物，W收获茎杆或初皮纤维为栽培目的。而杂种优势的利用极大 的提高了红麻的茎杆和初皮纤维产量，红麻表现出强大的杂种优势，其优势率高达35%~ 40%。长期W来，红麻杂种优势利用是国内外红麻育种的主攻目标，而杂种优势的利用有赖 于红麻不育细胞质的发掘，因此，发掘新的、不同类型的不育细胞质成为红麻杂交育种迫切 要求。周瑞阳（2008)报道的红麻CMS系均为野败型UG93细胞质，在生产上大面积推广来 源于单一细胞质的杂交种存在较大的风险，极可能成为某一病害生理小种的哺育品种，弓I 起该一病害大流行。因此，开发出能准确区别现有的不育细胞质的方法具有重要的意义。
[0003] 为了选育新的雄性不育细胞质，一般利用现有雄性不育保持系与现有种质资源测 交的方法筛选，不但工作量很大，而且带有很大的盲目性。若能找到一种快速准确鉴别红麻 雄性不育细胞质的方法，则可利用该种方法对现有种质资源进行鉴定，W发掘出新的雄性 不育细胞质资源，继而选育出新的雄性不育系。由此将极大地提高工作效率，并有利于现有 雄性不育系及其杂交种的知识产权保护。
[0004]SNP(SingleNucleotidePolymo;rphism,单核巧酸多态性）技术，指由于单个核巧 酸碱基的改变而导致的核酸序列的多态性。在不同个体的同一条染色体或同一位点的核巧 酸序列中，绝大多数核巧酸序列一致而只有一个碱基不同的现象，即SNP，而将分布在基因 编码区的SNP称为cSNP，属功能性突变。
[0005] 关于利用线粒体基因atp9的编码区的cSNP位点鉴定红麻不育细胞质的方法，目 前未见相关报道，该鉴定方法能有效的鉴定出来源UG93野败型突变体的不育细胞质，保护 现有雄性不育系及其杂交种的知识产权保护。
【发明内容】
[0006] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种与红麻细胞质不育相 关的SNP分子标记及其扩增引物。
[0007] 为了实现本发明的目的，本发明首先提供一种与红麻细胞质不育相关的SNP分子 标记，所述分子标记来自atp9基因，其核巧酸序列如SEQIDNo. 1所示，第290bp处为突变 位点，碱基为A或T。
[000引进一步地，所述突变位点的碱基为T时，红麻细胞质不育；所述突变位点的碱基为A时，红麻细胞质可育。
[0009] 本发明还提供了用于扩增所述SNP分子标记的引物对，所述引物对中，正向引物 atp9QF如SEQIDNo. 2 所示、反向引物atp9QR如SEQIDNo. 3 所示。
[0010] 本发明还提供了用于检测所述SNP分子标记的试剂盒，所述试剂盒含有正向引物 atp9QF如SEQIDNo. 2 所示、反向引物atp9QR如SEQIDNo. 3 所示。
[0011] 本发明还提供了一种检测红麻细胞质不育的方法，所述方法为；W待测红麻样品 的基因组DNA为模板，利用前述引物对，通过PCR反应进行扩增，并对扩增产物进行测序，根 据测序结果第290位点处的碱基判断样品细胞质是否不育。
[0012] 进一步地，所述碱基为T时，红麻细胞质不育；所述碱基为A时，红麻细胞质可育。
[0013] 本发明还提供了一种检测红麻细胞质不育的试剂盒，所述试剂盒含有前述引物 对。
[0014] 本发明还提供了所述SNP分子标记在检测红麻细胞质不育中的应用。
[0015] 本发明的有益效果在于：
[0016] 本发明基于线粒体基因atp9全长测序的基础上，通过比对红麻不育系、保持系W 及Fi代材料间的序列，发掘不育细胞质与可育细胞质材料间同一位点的碱基差异即cSNP， 从而提供了一种与红麻细胞质不育相关的SNP分子标记及其扩增引物。
[0017] 利用本发明所提供的SNP分子标记能将具有红麻不育细胞质的材料区别开来，非 常适用于鉴别材料间不育细胞质的真实性，对保护红麻细胞质雄性不育系的知识产权起到 重要作用。
【附图说明】
[0018] 图1为本发明实施例1中红麻线粒体基因atp9扩增图谱；
[0019] 其中，M ;marker，泳道1 ;不育系P3A ;泳道2 ;保持系P3B ;泳道3 ;Fi。
[0020] 图2为本发明实施例1中具有不育细胞质和可育细胞质材料的atp9序列比对部 分截图。
[0021] 图3为本发明实施例2中已知不育细胞质和可育细胞质材料的atp9序列比对部 分截图。
[0022] 图4为本发明实施例2中未知不育细胞质和可育细胞质材料的atp9序列比对部 分截图。
【具体实施方式】
[0023]W下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0024] 下列实施例中所用方法如无特殊说明均为常规方法。所用原料都可从商业途径获 得。引物合成及测序工作均由华大基因完成。
[0025] 实施例1与红麻细胞质不育相关的SNP分子标记的发掘
[0026] 本实施例的试验材料为红麻细胞质雄性不育系P3A、保持系P3B及Fi代，其中P3A、 P3B均为公知公用品种，具体信息如下：
[0027]P3A;又名粤丰1号A，见发明专利化200510019454. 4 (公开号CN100415083C)。
[0028]P3B;又名粤丰1号B，广西大学周瑞阳老师选育的细胞质雄性不育系P3A的雄性 不育保持系，见发明专利化200510019454. 4 (公开号CN100415083C)。
[0029] Fi代；W红麻细胞质雄性不育系P3A为母本，恢复系福红992为父本组配的杂交F1 代，Fi代的细胞质在理论上与亲本不育系具有相同的雄性不育细胞质。
[0030] 1.基于测序发掘线粒体atp9基因的特异cSNP位点
[0031] (1)线粒体atp9基因编码区引物设计
[0032] 基于红麻细胞质雄性不育系P3A线粒体基因atp9全长的序列
[0033] SEQ ID No. 1，设计了atp9基因编码区特异引物；
[0034] atp9QF ；ATGAATGATAAAGCGCGTGACGAGA；
[00巧]atp9QR ;TCAGCACGGTGCAGTCTCCACTTTA。
[0036] (2) atp9基因编码区扩增
[0037] 分别W红麻不育系P3A、保持系P3B和Fi代的曲NA为模板进行PCR扩增，扩增 的20yL反应体系包括20-50ng/yL的曲NA模板，2uL的10XByffer，0. 6uM的上下 游引物，用水补足20yL。该反应混合物首先95°C预变性3min，然后94°C40s，63°C20s， 72°C20s，扩增35个循环，最后72°C终延伸3min，PCR反应产物用1%的琼脂糖检测。红麻 线粒体基因atp9的扩增结果显示，该=个材料均获得了大小约为3(K)bp的电泳条带，经测 序得知此该S条带大小均为339bp(见图1)。
[003引 （3)已知不育细胞质和可育细胞质材料间特异cSNP位点发掘
[0039] 分别选取上述材料3个曲NA克隆子进行测序，采用DN