用于hras突变检测的引物、探针及检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，尤其设及一种用于HRAS突变检测的引物、探针及检测 试剂盒。
【背景技术】
[0002] RAS蛋白属于小的GTP酶，当与GTP结合时处于激活状态，与GDP结合时处于失活 状态。RAS蛋白是信号传导通路的中枢调控因子，控制着细胞的增生、分化和生长。RAS基 因是重要的原癌基因，其突变会造成癌症的发生。人类基因组中一共鉴别出KRAS、NRAS和 HRASS种RAS基因。KRAS和NRAS的2、3、4外显子在结直肠癌中易于发生突变，其突变与西 妥昔单抗和帕巧单抗等EGFR单抗抑制剂药物的临床用药有关。当KRAS和NRAS发生突变 时，使用西妥昔单抗和帕巧单抗治疗浸润性结直肠癌患者无效（NCCNClinicalPractice GuidelinesinOncologyforColonCancer. 2015)。
[000引HRAS基因是KRAS基因和NRAS基因的同源基因，位于第11号染色体的pl5. 5位 置。HRAS参与了生长因子介导的细胞增生过程。当细胞表面的受体被生长因子激活W后， 激活下游信号转导通路。HRAS是许多信号转导通路的上游驱动者，当HRAS与GTP结合时， 处于激活状态，开启下游的信号转导通路，当HRAS与GDP结合时，处于失活状态，关闭下游 的信号转导通路。膀脱细胞中HRAS的突变可W导致膀脱癌的发生。当HRAS的第12位密 码子从甘氨酸突变为鄉氨酸时，HRAS处于完全的激活状态，即使在没有外界信号传递的情 况下，HRAS也会驱动细胞的分裂和增生，从而形成肿瘤。HRAS的突变还预示着膀脱癌的 疾病进展和治疗后复发风险的提高炬haijeeF，NikiforovYE，Endocr化thol.2011S巧； 22(3) : 126-33)。
[0004]在甲状腺癌中，HRAS的突变频率为4%，大部分的突变位点为第3号外显子的第61 号密码子（COSMIC)。散发性甲状腺髓样癌HRAS的突变比例可达25%(JClin化docrinol Met油.2011May;96巧）：E863-8)。HRAS的突变还预示着甲状腺癌的远端转移。目前，针对 HRAS的药物筛选也进行到了临床研究（MouraMMetal.Espinosa,A.V.,J.Gi化ert,J. Fagin. 2014.HRASinThyroidCancer.MyCancerGenome)。
[0005] 虽然HRAS的临床意义越来越显现，但是，目前还没有可此陕速便捷、经济实效的 检测HRAS的突变的试剂盒。临床上一般使用sanger测序方法，此方法灵敏度低，只有20%， 耗时长，不适合临床大规模应用。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的；提供一种用于HRAS突变检测的引物、探针及检测试剂盒，采用了 特异的MGBBlocker探针，HRAS特异探针和引物，可W检测肿瘤组织中DNA中HRAS的突变； 利用MGBBlocker阻滞了HRAS非特异性的扩增，提高了其灵敏度，大于ARMS的1% ;可W 在循环肿瘤DNA中检测HRAS的突变；操作简单，检测廉价，可W大规模推广；检测速度快， 检测过程大约需要2小时就可完成。
[0007] 为了实现上述目的，本发明的技术方案是：
[000引一种用于HRAS突变检测的引物、探针，包括HRAS外显子2、3、4的外显子突变引 物、FAM-MGBhginan探针及Blocker封闭的MGB探针。
[0009] 所述的HRAS外显子2的12、13外显子位点点突变引物、FAM-MGB化qman探针及 Blocker封闭的MGB探针具体为；
[0010]
【主权项】
1. 一种用于HRAS突变检测的引物、探针，其特征在于：包括HRAS外显子2、3、4的外显 子突变引物、FAM-MGBTaqman探针及Blocker封闭的MGB探针； 所述的HRAS外显子2的12、13外显子位点点突变引物、FAM-MGBTaqman探针及Blocker封闭的MGB探针具体为：
所述的HRAS外显子3的61编码子位点点突变引物，FAM-MGB Taqman探针以及Blocker封闭的MGB探针具体为：
所述的HRAS外显子4的117编码子位点点突变引物，FAM-MGB Taqman探针以及Blocker封闭的MGB探针具体为：
2. 根据权利要求1所述的用于HRAS突变检测的引物、探针，其特征在于： 还包括人类基因组野生型位点引物，FAM-MGBTaqman探针，具体为： RefFCCAAGGCACGAGTAACAAGCTSEQIDNO：49 RefRAATTCCCAAGGACCACCTCACSEQIDNO: 50 Ref-TaqmanFAM-5-TCTCAGCCTCCAGAGGAT-3-BHQ-MGBSEQIDN0:51。
3. -种用于HRAS突变检测的检测试剂盒，其特征在于：通过所述的检测试剂盒提取 DNA样本，并进行PCR反应，所述的PCR反应体系如下：
4. 根据权利要求3所述的用于HRAS突变检测的检测试剂盒，其特征在于：所述的PCR 反应的条件如下。
5. 根据权利要求3所述的用于HRAS突变检测的检测试剂盒，其特征在于：所述的DNA 样本包括新鲜肿瘤组织或新鲜病理组织或石蜡包埋组织。
6. 根据权利要求3所述的用于HRAS突变检测的检测试剂盒，其特征在于：所述的DNA 样本的重量为1克。
【专利摘要】本发明公开了一种用于HRAS突变检测的引物、探针及检测试剂盒，包括HRAS外显子2、3、4的外显子突变引物、FAM-MGB Taqman探针及Blocker封闭的MGB探针。本发明检测位点全，检测HRAS的21种突变类型全面覆盖HRAS基因突变位点，很好的满足了临床的需求；利用MGB Blocker封闭探针，提高了检测的灵敏度，降低了非专一性结合，使得临床检测结果更好判读。
【IPC分类】C12Q1-68, C12N15-11
【公开号】CN104774954
【申请号】CN201510198560
【发明人】张道允, 巩子英
【申请人】上海允英医疗科技有限公司
【公开日】2015年7月15日
【申请日】2015年4月23日