双调蛋白特异性-双螺旋寡核糖核苷酸,包含双螺旋寡核糖核苷酸的双螺旋寡核糖核苷酸 ...的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种与呼吸道疾病相关的基因特异性-双链寡核糖核苷酸和一种包 含所述双链寡核糖核苷酸的高效双链寡核糖核苷酸结构，在本发明中，该双链寡核糖核 苷酸结构包含一亲水性化合物和疏水性化合物，它们通过一个简单的共价键或者由连接 物-介导的一个共价键结合在双链RNA (siRNA)的两端，从而使上述双链寡核糖核苷酸被有 效的传递到细胞内，且该双链寡核糖核苷酸结构通过其在水溶液中相互间的疏水作用可被 转化成纳米粒。所述双链寡核糖核苷酸结构中的该双链寡核糖核苷酸对双调蛋白具有较好 的特异性，是一种特别好的双调蛋白特异性-siRNA(amphiregulin_specific siRNA)，其中 双调蛋白基因是一种与呼吸道疾病相关的基因。
[0002] 此外，本发明还涉及一种制备所述双链寡核糖核苷酸结构的方法和一种用于预防 或治疗呼吸道疾病尤其是慢性阻塞性肺疾病（COPD)和/或特发性肺纤维变性（IPF)的药 物组合物，该药物组合物包括上述双链寡核糖核苷酸结构。
【背景技术】
[0003] 在治疗疾病药物的发展中和靶标确认中，抑制基因表达的技术是一个重要的工 具。为靶基因导入一转基因的技术，作为抑制靶基因表达的传统技术，已经被公开，该 技术包括在启动子的反义链方向导入转基因的方法（Sheehy et al.，Proc.Natl.Acad. Sci.，USA, 85:8805-8808, 1988 ;Smith et al.，Nature, 334:724-726, 1988)和在启动 子的有义链方向导入转基因的方法（Napoli et al.，Plant Cell，2:279-289，1990;van der Krol et al. , Plant Cell, 2:291-299, 1990 ；US Patent No. 5, 034, 323 ；US Patent No. 5, 231, 020 ；and US Patent No. 5, 283, 184) 〇
[0004]同时，最近报道了转录后的基因沉默或者RNA干扰（RNAi)是由一个具有20-25 个碱基对的双链RNA片段的累积引起的，该双链RNA是由RNA模板合成的（Hami 1 ton& Baulcumbe, Science, 286:950-952, 1999)。上述双链DNA片段被命名为"短干扰核糖核 酸（在下文中用siRNA指代）"。此后，siRNA被证实是抑制各种生命有机体的基因表达 的一个重要的因素，包括哺乳动物（Fire et al.，Nature, 391:806-811，1998 ;Timmons& Fire, Nature, 395:854, 1998 ；Kennerdell&Carthew, Cell, 95:1017-1026, 1998 ；Elbashir et al., Nature, 411:494-497, 2001 ;TO 99/32619)。此外，已知双链 siRNA 被细胞内 的RISC (RNA诱导沉默复合物）蛋白复合物转化为单链RNA，然后结合到目标mRNA上使 目标 mRNA 失活（Novina&Sharp, Nature, 430:161-164, 2004)。利用上述 siRNA 来抑制 基因表达的技术，被用来抑制靶细胞内的靶基因的表达，和观察由此引发的改变，也被有 利地用在致力于鉴定靶细胞内的靶基因的功能的研宄上。特别地，抑制易传染病毒或癌 细胞中的靶基因的功能这种方式被认为可有效的用于治疗相关疾病的方法的发展。在 实验动物上进行的体外研宄和体内研宄结果表明，靶基因被siRNA诱导沉默是有可能的 (McCaffrey et al.,Nature Biotechnology, 21:639-644, 2003 ；Giladi et al., Molecular Therapy，8:769-776, 2003 ;Konishi et al.，epatology，38:842-850, 2003 ;Sen et al.，Virus Research，96:27-35, 2003 ;Yokota et al.，EMBO Reports，4:602-608, 2003; Song et a 1. , Nature Medicine，9:347-351，2003 ;McCaffrey et al.，Nature，418:38-39, 2002)。例如，国际专利公开号为WO 03/070969的专利中公开了一 种通过利用siRNA抑制Bcl2蛋白质在癌细胞中的表达来治疗癌细胞的方法，国际专利公开 号为W0 04/009769的专利中公开了一种通过利用siRNA抑制血管原性VEGF蛋白的表达来 治疗癌细胞的方法。
[0005]同样地，因为siRNA可以以序列特异性的方式互补地结合在革El mRNA上来调节 靶基因的表达，siRNA与传统的抗体药物或化学药物（小分子药物）相比，可以被有利 地用在非常广范围的应用中。（Progress Towards in Vivo Use of siRNAs. MOLECULAR THERAPY. 200613(4):664-670)。
[0006] siRNA具有极好的效果且可被用在广泛范围内的应用中，但为了使siRNA发展到 治疗药物中，还需要改善siRNA的体内稳定性和细胞内的传递有效性，从而有效地将siRNA 传送到它的革El细胞中（Harnessing in vivo siRNA delivery for drug discovery and therapeutic development. Drug Discov Today. 2006Jan ;11 (1-2):67-73)〇
[0007] 为了改善siRNA的体内稳定性并解决与siRNA的先天性免疫刺激相关的问题，对 以下技术的研宄已在积极进行中：通过修改siRNA上的一些核苷酸或siRNA骨架的方法 来改善其体内稳定性从而使siRNA对核酸酶具有抵抗性的技术，或是利用载体比如病毒载 体、脂质体或者纳米颗粒的技术。
[0008] 包含病毒载体如腺病毒或逆转录酶病毒的传送系统具有高转染效能，但携带了免 疫原性和致瘤性的风险。另一方面，相比于病毒载体，非病毒载体包括纳米颗粒被评估具有 低细胞内传递效能，但也有其优势，包括体内高安全性，靶向特异性传送，有效的摄入和包 裹RNA寡核苷酸进入细胞或组织，以及低细胞毒性和低免疫刺激性。因此，相比于病毒传送 系统，这些非病毒载体被认为是一种有前景的传送方法（Nonviral delivery of synthetic siRNAs in vivo. J Clin Invest. 2007December 3 ；117 (12):3623 - 3632)〇
[0009] -种利用非病毒传送系统中的纳米载体的方法里，纳米颗粒是用各种多聚物制成 的，比如脂质体，一种阳离子多聚物复合物及类似物，siRNA被附载在这些纳米颗粒上（即 纳米载体），然后被传送至细胞内。上述方法中，主要用到聚合的纳米颗粒，聚合微胞，阳 离子脂质体和类似物。在它们当中，由阳离子脂质构成的阳离子脂质体与细胞中内涵体 的阴离子脂质相互作用使内涵体不稳定，从而将siRNA传送至细胞内（Proc. Natl. Acad. Sci. 15 ；93 (21):11493-8, 1996)〇
[0010] 此外，已知可以在siRNA过客链（有义链）的末端区域结合一个化合物或类似物 来增加siRNA的体内效能，以改善其药代动力学特征（Naturell ;432 (7014) : 173-8, 2004)。 在这个例子中，siRNA的稳定性会根据结合在siRNA有义链（过客链）或反义链（引导链） 的末端的化合物的性质而有所不同。例如，在阳离子化合物存在的条件下，结合了多聚化合 物如聚乙二醇（PEG)的siRNA与siRNA的阴离子磷酸基团相互作用形成一个复合物，从而 得到具有更好的siRNA稳定性的载体（J Control Release 129 (2): 107-16, 2008)。特别地， 由多聚物复合物制成的微胞相比于其它药物传送系统比如微球或者纳米颗粒，微胞体积很 小，大小分布高度一致，且自发形成。因此，这些微胞在易于把握制剂的质量，容易确保微胞 的再现性方面有优势。
[0011] 进一步地，为了改善siRNA在细胞内的传送效能，一项利用siRNA配合物来确 保siRNA的稳定性并增加siRNA的细胞膜渗透性的技术已经发展起来了（Korean Patent Registration No. 883471)，上述siRNA配合物是由一亲水性的化合物（例如，聚乙二醇 (PEG))，该化合物是生物相容的多聚物，通过一个简单的共价键或一个连接物-介导的共 价键结合到siRNA上而得到的。然而，即使经过化学修饰并结合到聚乙二醇（PEG)上， siRNA在体内的稳定性依然低且不容易被传送至目标器官内。为了解决这些缺点，包含结 合在寡核糖核苷酸上的亲水化合物和疏水化合物的双链寡核糖核苷酸结构，尤其是双链 寡核糖核苷酸如siRNA，已经被改进了。这些结构通过疏水化合物的疏水作用形成了被命 名为SAMiRNA(自动组装的微胞抑制性RNA)的自动组装的纳米颗粒（see Korean Patent Registration No. 1224828)。SAMiRNA技术相比于传统的传送技术的优势在于能得到体积 很小的勾质的纳米颗粒。
[0012] 同时，已知双调蛋白与上皮生长因子受体结合激活上皮生长因子受体（EGFR)通 路，与细胞的增值有关。据报道称双调蛋白的表达可以被双调蛋白特异性-siRNA抑制，且 上述抑制作用展示出对特定类型的乳腺癌的治疗效果（Cancer Res. 2008 ;68:225-2265)。 而且，据报道称炎症乳腺癌中的细胞渗入可被一种双调蛋白特异性-shRNA抑制（J Cell Physiol. 2011226(10) :2691-2701)，当双调蛋白的表达被shRNA抑制时，暴露在香烟烟雾 中的大鼠的肺动脉重构就被抑制了（Arch Biochem Biophys，l ;508(1):93_100)。已知双调 蛋白涉及气道平滑肌（ASM)增生和血管生成，特别地，双调蛋白刺激了哮喘病人体内的气 道重构（J Korean Med Sci 2008;23:857-863)，且双调蛋白和由急性哮喘引发的组织重构 中分泌过量的上皮生长因子（EGF)，均涉及哮喘病人的气道重构（J Alergy Clin Immunol 2009 ；124:913-920)〇
[0013] 慢性阻塞性肺疾病（下文中用"C0PD"指代）是一种典型的肺疾病哮喘重叠症，由 于它涉及不可逆的气道阻塞，所以不同于哮喘。呼吸道疾病显示出逐渐递增的且不完全可 逆的气流限制，该气流限制与由反复感染、有害气体的吸入或吸烟引发的肺的非正常炎症 反应有关（Am J Respir Crit Care Med, 163:1256-1276, 2001)。C0PD 的严重性已受到全 世界的重视。在1990年C0PD是排名第六的死因，但到2020年，C0PD有望成为排名第三的 死因。coro是发生率上升中的前十大死因中唯一的一种疾病。它也有望成为排名第四的 因伤住院的原因，从而使社会和经济负担迅速增大（Lancet, 349:1498-1504, 1997)。慢性 肺阻塞性疾病（C0PD)是因由气道和软组织炎症造成的细支气管和软组织病变引起的，其 特点是闭塞性支气管炎和肺气肿（软组织损伤）。C0PD的实例包括慢性阻塞性支气管炎， 慢性细支气管炎和肺气肿。在C0PD的病例中，嗜中性粒细胞的数量增加，分泌细胞因子如 GM-CSF，TNF-a，IL-8或MIP-2。此外，气道发生炎症，肌肉壁变厚，粘液分泌增加引发气道 阻塞。当气道被阻塞时，肺泡将扩大并受到损伤，从而使得肺泡的二氧化碳交换氧气的能力 遭到破坏，形成呼吸衰竭。在韩国，8%的45岁及以上的成年人患有慢性阻塞性肺疾病，但 是人们的注意力还是在肺癌上。在治疗慢性非阻塞性肺疾病的传统方法中，主要用到具有 抗炎活性或支气管扩张效果的治疗药物，而用基因治疗药物对慢性非阻塞性肺疾病做基本 预防和治疗是很少的。具有抗炎活性的代表性治疗药物包括糖皮质激素，白三烯修饰物，茶 碱及类似物。在它们当中，糖皮质激素具有很好的效果，但由于其副作用它的服用方式是吸 入，且糖皮质激素没有选择性地抑制炎症反应，它抑制所有的免疫反应，因此在一些病例中 甚至抑制了必要的免疫反应。白三烯修饰物具有很少的副作用，但效果有限，因此不能单独 使用来控制哮喘。因为这个原因，白三烯修饰物作为辅助药物用得最多。茶碱治疗慢性非阻 塞性肺疾病的效果不是很好，且可引发副作用。因此，为了预防和治疗慢性阻塞性肺疾病， 急需一种新的具有很好的疗效且引发的副作用少的治疗药物。
[0014] 同时，特发性肺纤维化（下文表示为"IPF"）是这样一种疾病，当发生各种致使肺 硬化的改变而引发肺组织结构的重大改变时，慢性炎性细胞渗入肺泡壁，使肺功能逐渐被 损害，导致死亡。目前能够有效治疗IPF的方法还未知，患有IPF的病人预后不佳，平均存 活时间为诊断后3-5年。据报道称，在国外IPF的发生率大概是每十万个人中有3-5个人 患有IPF。而且，已知IPF发生在50岁以上年纪的人身上，且男性发病率比女性高。
[0015]目前IPF发展的原因还没有被明确指出，据报道称IPF在吸烟者身上的发病率高， 抗抑郁药，胃食管的回流引起的慢性肺吸入，金属粉尘，木肩或者溶剂的吸入等等都是与 IPF发展有关的危险因素。然而，在大部分IPF病人中未能发现具有一定因果关系的因素。
[0016] 已知，当IPF没有得到治疗时，它会持续恶化，约50 %或50%以上的IPF病人会在 诊断后的3-5年内去世。而且，当IPF完全发展为纤维症后，任何治疗都不能缓解它了。因 此，当IPF在早期得到治疗时，治疗IPF的可能性就会高。作为IPF的治疗药物，目前已知 的类固醇和硫唑嘌呤的结合物，或环磷酰胺未显示出特别的效果。此外，各种纤维化抑制剂 已尝试性的用于动物试验和少数病人身上，但未证明有显著的效果。特别地，对于IPF晚期 病人的非肺移植的治疗方法，目前还没有被报道过。因此，急需发展一种更有效的IPF治疗 药物。
[0017][现有技术文献]
[0018][专利文件]
[0019]专利文件 1:U. S. Pat. No. 5, 034, 323
[0020] 专利文件 2: U. S. Pat. No. 5, 231，020
[0021] 专利文件 3: U. S. Pat. No. 5, 283, 184
[0022] 专利文件4:韩国专利授权公报883471号
[0023] 专利文献5:韩国公开专利第2009-0042297号
[0024][非专利文件]
[0025]非专利文件 1:Proc. Natl. Acad. Sci.，USA, 85:8805-8808, 1988
[0026]非专利文件 2: Smith et al.，Nature, 334:724-726, 1988
[0027]非专利文件 3:Plant Cell, 2:279-289, 1990
[0028]非专利文件 4:Plant Cell, 2:291-299, 1990
【发明内容】
[0029] 本发明旨在解决发生在现有技术中的上述问题，本发明的目的是提供一种能以对 双调蛋白具有特异性的方式高效地抑制双向蛋白基因的表达的新颖的双链寡核糖核苷酸， 尤其指siRNA，一种包含所述新颖寡核糖核苷酸的双链