一种毕赤酵母菌基因工程杂合抗菌肽cc29及其获得方法

文档序号:8467625阅读:496来源:国知局
一种毕赤酵母菌基因工程杂合抗菌肽cc29及其获得方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程和生物技术领域,具体涉及一种毕赤酵母菌基因工程杂合抗 菌肽CC29及其获得方法。
【背景技术】
[0002] 抗菌肽是生物先天性免疫系统的重要组成部分,是经免疫诱导产生的一类抵抗外 界病原体感染具有生物活性的小分子多肽。抗菌肽具有广谱抗菌作用,尤其是对一些产生 抗生素耐药性的病原菌的杀灭作用更引起了人们对它的兴趣。抗菌肽在农业、医疗、食品等 领域的应用潜力巨大。迄今为止,已经发现了上千种天然抗菌肽,但是具有较好的医疗选择 指数的种类却比较少,因此,如何能够获得抑菌效果好、产量高的抗菌肽一直受到研宄者的 普遍关注。目前,抗菌肽的获得方法主要有三种:(1)直接从生物体中提取天然肽,但含量 非常少,且提取工艺复杂,成本较高,难以满足大规模生产的要求;(2)化学方法合成。这种 方法只适用于非常短的抗菌肽,但大多数抗菌肽分子量都比较大,不适合化学合成;(3)分 子量比较大的抗菌肽大多都采用基因工程的方法,该方法研宄的比较透彻,而且是生产抗 菌肽的有效途径。因此,人们希望通过分子上的重新设计,例如,杂合肽的设计等方式从丰 富的天然抗菌肽资源中获得理想的新型人工抗菌肽。
[0003] 杂合抗菌肽的设计特点是集两个(或以上)天然肽的优点于一身,经过适当的 人工修饰后,可以扬长避短,最大程度上发挥抗菌活性,并不引起溶血。天蚕素抗菌肽 (cecropins)是目前研宄最清楚、效果最好的天然抗菌肽;家幡天蚕素抗菌肽(CecMd)是 本实验室经诱导家蝇幼虫,然后克隆得到的(同源性81%)。而Chensirin是近年来发现 的中国东北林蛙皮肤上分泌的天然抗菌肽,其活性很高,但具有较高的溶血活性。如果能够 对两者进行杂合设计,将会为抗菌肽的规模化生产奠定基础。

【发明内容】

[0004] 为解决上述问题,本发明提供了一种毕赤酵母菌基因工程杂合抗菌肽CC29及其 获得方法。
[0005] 为实现上述目的,本发明采取的技术方案为:
[0006] 一种毕赤酵母菌基因工程杂合抗菌肽CC29,所述抗菌肽CC29包括两对引物,其核 苷酸序列为:
【主权项】
1. 一种毕赤酵母菌基因工程杂合抗菌肤CC29,其特征在于,所述抗菌肤CC29包括两对 引物,其核巧酸序列为:
所述核巧酸序列前端引入=肤序列,所述核巧酸序列两端各加入了Ba恤I和SalI限制性内切酶位点和保护性碱基,末端加上终止密码子,所述抗菌肤CC29的分子量为 3236. 00 ;电荷数为巧.5 ;等电点为11. 22 ;疏水力矩为0. 35。
2. -种毕赤酵母菌基因工程杂合抗菌肤CC29的获得方法,其特征在于,包括如下步 骤: 51、 根据Genbank中化ensirin序列W及实验室克隆得到的家蛹天蚕素抗菌肤序列,选 取具有潜力的片段进行组合,应用生物信息学工具计算各组合的一级特征参数、预测二级 和S级结构和抗菌活性,筛选出医疗潜力指数最大的组合CC29,在其两端加上化0I和甜a I限制性内切酶位点和保护性碱基,末端加上终止密码子,合成两对引物F1、R1,F2、R2,应 用重叠PCR技术合成CC29融合蛋白基因; 52、 构建CC29克隆载体、pGAPZaA/CC29并测序鉴定,构建表达载体pGAPZaA/CC29并 测序鉴定,将重组的克隆pGAPZaA/CC29与表达载体pGAPZaA同时双酶切,获得的目的基 因与同样酶切的表达载体连接构建重组表达载体pGAPZaA/CC29,将杂合抗菌肤CC29表达 载体转化到宿主菌SMD1168中,获得杂合抗菌肤CC29的重组原核表达基因工程菌; 53、 使用IPTG对培养至对数期的杂合抗菌肤CC29大肠杆菌基因工程菌进行诱导,通过 SDS-PAGE和westernblot技术对CC29融合蛋白进行检测,W便确定其表达水平和表达方 式; 54、 将杂合抗菌肤基因构建在毕赤酵母表达载体pGAPZaA上,电转化到宿主菌 SMD1168后,使用YTO液体培养基培养3天,杂合抗菌肤表达出分泌蛋白;对表达载体表达 出的蛋白进行层析纯化,纯化后的融合蛋白经甲酸切割后去除标签,然后进行定量,纯化样 品保留; 55、CC29的生物学活性鉴定。
3. 根据权利要求2所述的一种毕赤酵母菌基因工程杂合抗菌肤CC29的获得方法,其特 征在于,所述步骤S5过程中包括;将杂合抗菌肤CC29经沸水浴2min、5min、10min、30min和 60min的热稳定性检测;将杂合抗菌肤CC29在抑为1、2、5、7、10、12、14缓冲液中,W沙口 氏菌为指示菌的杀菌活性检测;通过抑菌圈法和连续倍比稀释法测定杂合抗菌肤CC29对 大肠杆菌、乳酸杆菌、鸡沙口氏菌、停乳链球菌和金黄色葡萄球菌的抑菌活性和最小抑菌浓 度;采用红细胞血红素的释放测定杂合抗菌肤CC29的溶血活性。
【专利摘要】本发明公开了一种毕赤酵母菌基因工程杂合抗菌肽CC29及其获得方法,将实验室克隆得到的家蝇天蚕素抗菌肽与中国林蛙抗菌肽Chensirin作为母体肽,进行杂合设计,获得了低溶血、高抗菌活性的新型杂合肽及其高效表达的发酵菌株,与天然肽相比具有更大的优势,为抗菌肽的规模化生产奠定基础。
【IPC分类】C07K19-00, C12N15-81
【公开号】CN104788568
【申请号】CN201510027047
【发明人】张爱忠, 姜宁, 张晨雪, 蔡鹏 , 朱双, 刘晓明, 祁丽
【申请人】黑龙江八一农垦大学
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2015年1月16日
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