不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌株和混合菌群及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及农产品安全领域，尤其涉及一种不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌株和混合 菌群及其应用。
【背景技术】
[0002] 黄曲霉毒素主要由黄曲霉（Aspergillus flavus)和寄生曲霉（Aspergillus parasiticus)的代谢产物，是迄今发现的污染农产品毒性最强的一类生物毒素。其中，毒性 最强、危害最大的为黄曲霉毒素B1，其毒性为氰化钾的10倍、砒霜的68倍，被列入严管的 特剧毒物质。农产品黄曲霉毒素污染已成为影响食品安全和危害人们身体健康的重要污染 物。
[0003] 据世界粮农组织估计，目前世界范围内有25%的农作物产品受真菌毒素的污染， 其中主要就是黄曲霉毒素。近年来，世界各国不仅纷纷制订了相应的黄曲霉毒素限量标准 和法规，而且其允许上限均有进一步降低。1998年欧盟委员会通过了 1525/98号指令，公 布了欧盟国家食品中黄曲霉毒素的最高限量：规定人类直接食用的花生及其制品中黄曲霉 毒素（B1+B2+G1+G2)从20yg/kg统一降到4yg/kg，其中，B1彡2yg/kg。目前，黄曲霉 毒素污染对农产品输出国的对外贸易已产生了严重影响。黄曲霉毒素主要污染花生、玉米 等作物，严重影响我国花生、玉米等作物及其制品的出口，给我国的出口贸易带来了巨大损 失。因此，黄曲霉毒素的有效防治与控制，对于保障我国食品安全和提升我国农产品出口竞 争力具有重要意义。
[0004] 利用不产黄曲霉毒素来抑制产毒菌菌群数量及产毒量的生物防治是目前控制农 产品黄曲霉毒素非常有效的手段。美国近来在黄曲霉毒素生物防治研宄方面已取得重大进 展，已经批准两个不产毒素的黄曲霉生防菌株（AF36和NRRL21882)，该黄曲霉生防菌株在 大田大面积使用，取得了显著的经济和社会效益。利用不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌株NRRL 21882能有效防治花生黄曲霉毒素污染，其防效可达90%以上，使花生中黄曲霉毒素的含 量能有效控制在限量标准范围内。但是，美国的生防菌株在对非洲黄曲霉群体没有很好的 抑制作用，而非洲分离到的高竞争力的不产毒素的菌株对非洲产毒黄曲霉则有很好的抑制 作用。这表明，不同地区的不产毒素的黄曲霉生防菌株有其一定的适用范围。单个生防菌 在田间施用常因为生防菌株的适生性问题而导致防效不稳定的情况。我国在黄曲霉毒素生 防防治方面还处于初步阶段，暂无登记的防治黄曲霉的生防菌剂。筛选、开发利用防治黄曲 霉毒素的生物农药，对解决我国农产品黄曲霉毒素污染问题将具有重要的应用价值。
[0005] 纤维素由2000-10000个葡萄糖分子组成的长链大分子，在植物体中的含量最多， 约占植物干重的1/2。除反刍动物借瘤胃微生物可以利用纤维素外，其他高等动物几乎不能 消化和利用纤维素。我国是一个饲料资源十分紧张的国家，土地少、人口多，人畜争粮的矛 盾十分突出。饲料资源匮乏阻碍了我国畜牧业的发展，因此，成功开发这一潜在饲料资源显 得尤为迫切和重要。微生物添加剂指由许多有益微生物及其代谢产物和生长促进物质组 成的，可直接饲喂动物，提高反刍动物对饲料利用率的重要添加剂。其中，产纤维素酶的有 益微生物饲料添加剂，能显著提高反刍动物对纤维素的利用效率。因此，筛选、开发产纤维 素酶的有益微生物作为饲料添加剂具有改善饲料的营养价值，降低饲料成本和提高经济效 益，具有广阔的开发前景。
【发明内容】
[0006] 本发明提供了一种不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌株和混合菌群及其应用，该黄曲霉 菌株和混合菌群均能有效抑制玉米和花生中的黄曲霉毒素的形成，降低农产品中黄曲霉毒 素的污染；此外，A051、AF052和AF053还能够分泌纤维素酶，利用该黄曲霉制备的生防菌群 处理的玉米及秸杆作为动物饲料时，其携带的生防菌产生纤维素酶，能够降解纤维素，提高 畜牧对饲料的利用效率。
[0007] 本发明提供了一种不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌株，命名为黄曲霉（Aspergillus flavus)AF052,保藏编号为CGMCC NO. 9858,保藏日期为2014年11月20日。
[0008] 本发明提供了一种不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌株，命名为黄曲霉（Aspergillus flavus)AF053,保藏编号为CGMCC NO. 9859,保藏日期为2014年11月20日。
[0009] 本发明还提供了一种不产黄曲霉毒素的黄曲霉混合菌群，由黄曲霉（Aspergillus flavus)A051、黄曲霉（Aspergillus flavus)AF052 和黄曲霉（Aspergillus flavus)AF053 混合而成；
[0010] 所述黄曲霉（Aspergillus flavus)A051的保藏编号为CGMCC NO. 2556,保藏日期 为2008年6月24日；
[0011] 所述黄曲霉（Aspergillus flavus)AF052的保藏编号为CGMCC N0. 9858,保藏日期 为2014年11月20日；
[0012] 所述黄曲霉（Aspergillus flavus)AF053的保藏编号为CGMCC N0. 9859,保藏日期 为2014年11月20日。
[0013] 所述黄曲霉混合菌群的组建是按照不同地理来源进行组合的，以降低生防菌剂 在田间应用过程中的防效不稳定问题和扩大该生防菌剂的适用地域范围；具体地，黄曲 霉（Aspergillus flavus)A051分离自浙江省绍兴市，即长江流域；黄曲霉（Aspergillus flavus)AF052分离自山东省莱西市，SP黄河流域；黄曲霉（Aspergillus flavus)AF053分 离自福建省漳浦县，即东南沿海地区。
[0014] 所述黄曲霉混合菌群的组建还同时具有不产毒黄曲霉遗传多样性。各菌株在产 毒基因簇上缺失的基因存在差异；具体地，黄曲霉（Aspergillus flavus)A051缺乏黄曲 霉毒素合成基因 Cl、C2、C3、norB、cypA、aflT、pksA、norl、hexA、hexB、aflR、aflj、adhA、 estA和norA;黄曲霉（Aspergillus flavus)AF052缺乏黄曲霉毒素合成基因C2、C3、norB、 cypA、aflT、pksA、nor 1、hexA、hexB、aflR、aflj、adhA、estA 和 norA ;黄曲霉（Aspergillus flavus)AF053缺乏黄曲霉毒素合成基因Cl、C3、norB、avnA、vbs ;因此，A051菌株、AF052菌 株和AF053菌株均不能合成黄曲霉毒素。
[0015] 作为优选，所述的混合菌群中，黄曲霉（Aspergillus flavus)A051 CGMCC N0.2556、黄曲霉（Aspergillus flavus)AF052 CGMCC NO. 9858 和黄曲霉（Aspergillus 打已￥118)4?053 06110：勵.9859的菌体数比例为1:1:1〇
[0016] 本发明还提供了所述的菌株或混合菌群在抑制产黄曲霉毒素的黄曲霉生长中的 应用。
[0017] 具体地，所述黄曲霉生长在农产品中。
[0018] 所述的农产品为谷物、油料作物、坚果、香辛料、饲料原料、中草药或水果；优选地， 所述的农产品为玉米或花生。
[0019] 本发明还提供了一种用于抑制产黄曲霉毒素的黄曲霉产毒的生防菌剂，所述菌剂 的活性成分为所述的菌株或混合菌群。
[0020] 所述的生防菌剂的制备方法，包括：黄曲霉（Aspergillus flavus)A051、黄曲霉 (Aspergillus flavus)AF052和黄曲霉（Aspergillus flavus)AF053分别单独发酵后，将得 到的菌液混匀，制备获得生防菌剂。
[0021] 所述的发酵过程包括：以小麦为基质，将小麦浸泡、高温灭菌后，接种黄曲霉菌株， 在28°C温度、0. 04-0. 06Mpa气压下发酵48小时。发酵终止后，将温度升至40°C，搅拌烘干 的发酵产品。
[0022] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0023] (1)本发明分离获得的黄曲霉不产黄曲霉毒素，能有效抑制农产品中的黄曲霉毒 素的形成，降低农产品中黄曲霉毒素的污染，提高农产品质量；
[0024] (2)本发明将不同地域分离获得的不产黄曲霉毒素的黄曲霉进行混合制备生防菌 剂，克服了现有生防菌剂对不同地域防治效果存在差异的问题，有效降低了本发明生防菌 剂在田间应用过程中防效不稳定的问题，并扩大了该生防菌剂的适用地域范围；
[0025] (3)本发明分离获得的黄曲霉（Aspergillus flavus)A051 CGMCC N0. 2556， AF052CGMCC NO. 9858 和黄曲霉（Aspergillus flaus)AF053 CGMCC NO. 9859 可分泌纤维素 酶，利用该黄曲霉制备的生防菌群处理后的玉米、秸杆作为动物饲料时，其产生的纤维素酶 能有降解纤维素，提高反刍动物对饲料的利用率。
【附图说明】
[0026] 图1为本发明黄曲霉菌株A051、AF052和AF053中黄曲霉毒素合成基因缺失示意 图。
[0027] 图2为本发明黄曲霉菌株A051、AF052和AF053产生纤维素酶的活平板测定结果 图。
【具体实施方式】
[0028] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0029] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0030] 黄曲霉毒素B1购于Sigma公司。
[0031] 实施例1不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌株的分离、鉴定
[0032] 1、从土壤、玉米、花生等生境中分离黄曲霉菌株
[0033] 从江苏、浙江、山东、福建、安徽等地的玉米、花生田块中采集土壤，将该土壤用YES 培养基培养分离黄曲霉菌株。每升YES培养基成分：酵母提取物lg，蔗糖10g，NaCl 60g，琼 脂2(^，灭菌后加入&^04.21^0411^，0.4%氯硝胺51111，链霉素100 1^/111匕
[0034] 2、用生物测定、薄层层析以及酶联免疫法分析菌株产生黄曲霉毒素的情况。
[0035] 具体如下：
[0036] 生物测定方法：将分离到的黄曲霉菌株接种在含0. 3%环状糊精的YES培养基上， 30°C培养7天后，将菌落用25 %氨水熏蒸3分钟，如果菌落背面呈粉红色，该菌株为产毒菌 株；如果菌落背面不变色，该菌株可能是不产毒素菌株，需进行下一步的薄层层析检测。薄 层层析测定方法：将分离到的黄曲霉菌株接种在含〇. 3%环状糊精的YES培养基上，30°C培 养7天后，收集100毫克菌丝和孢子，置于1. 5毫升的离心管中，并向其中加入200微升的 80%甲醇；室温下震荡30分钟后10, 000g离心5分钟，取50微升上清液点到硅胶层析板 上，吹干后将薄层层析板置于展布槽内用无水乙醚预展12厘米，取出凉干后在经过丙酮： 三氯甲烷（8 : 92)展开10~12cm，然后，取出层析板，365nm紫外灯下观测，有淡蓝色银光 斑点的菌株为产毒菌株；如果没有淡蓝色银光斑点，说明该菌株很可能是不产毒菌株，这些 菌株可进行下一步分子生物学检测。
[0037] 酶联免疫法检测菌株是否产生黄曲霉毒素：按照中华人民共和国国家标准GB/ T 5009.22-2003《食品中黄曲霉毒素B1的测定》方法，并利用北京市营养源研宄所研发的 ELISA定量试剂盒定量检测黄曲霉毒素B1。
[0038] 通过上述方法分析，筛选出不产黄曲霉毒素的菌株A051，分离自浙江省绍兴市的 土壤；不产黄曲霉毒素的菌株AF052,分离自山东省莱西市的花生上；不产黄曲霉毒素的菌 株AF053,分离自福建省漳浦县的土壤。
[0039] 3、菌株的分子鉴定
[0040] 通过钙调基因序列对真菌A051、AF052和AF053进行分子鉴定（Rodrigues P， Santos C，Veniincio A,Lima N. ,2011. Species identification of Aspergillus section Flavi isolates from Portuguese almonds using phenotypic, including MALDI-T0F ICMS，and molecular approaches. J Ap