一种鉴定水稻垩白主效基因的基因型的分子标记及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物生物技术领域，更具体地，涉及一种鉴定水稻垩白主效基因的基因型的分子标记及其应用。
【背景技术】
[0002]水稻是我国重要的农作物，稻米品质直接关系到水稻生产的经济效益和人民的生活质量。垩白是稻米胚乳中不透明的部分，是我国稻米外观品质中最重要的衡量指标之一。垩白粒率低、无垩白的稻米具有优良的外观特性；此外，垩白率低的稻米整精米率一般也相应较高，碾磨后碎米少，商品价值高。因此，低垩白水稻品种深受稻米加工企业和消费者的欢迎。水稻垩白性状受遗传因素和环境因素共同控制，其中遗传因素是影响稻米垩白性状的主要因素。
[0003]在优质稻米品种选育过程中，低垩白特性一直是育种家的重要目标。传统垩白性状往往需要在水稻成熟获得一定数量籽粒后，利用目测、图像扫描等方法对垩白程度进行分级或者计算。目测方法由于主观随意性大，测定的灵敏度、准确性和可重复性均难以得到保证；而图像扫描方法比较精确和客观，但是操作相对繁琐和费时，难以在育种早期世代进行选择。因此，利用分子标记实现对垩白调控基因直接选择，是实现水稻低垩白特性高效选择的有效手段。
[0004]前人研宄表明，第5号染色体上编码液泡膜质子转运焦磷酸酶的L0C_0s05g06480，是影响水稻籽粒垩白的形成和精米率等品质性状的关键基因(Li Y, FanC， Xing Y， et al.Chalk5 encodes a vacuolar H+-translocating pyrophosphataseinfluencing grain chalkiness in rice.Nature genetics, 2014)。现有技术报道自然种质群体中该位点大致涵盖7种单体型，系统发生树的构建将这7种单体型归为两类，并找到若干个保守的SNP位点。其中，位于该基因的启动子区域-576位的SNP位点T/C变异具有重要应用价值。因此，对该SNP位点进行基因分型可实现对不同垩白特性的分子鉴定，提高在育种早期世代的垩白特性选择效率。
[0005]传统SNP位点鉴定通常基于测序、酶切或基因芯片进行分析，在大量样品鉴定时成本较高，难以满足育种需求。四引物扩增受阻PCR (ARMS-PACR)能够针对SNP位点进行特异等位扩增。针对已知的变异位点，于两侧分别设计I对外引物和I对特异性内引物，特异性内引物3’末端碱基必须落在突变点的位置上，从而选择性地扩增突变型与野生型个体基因。在同一次扩增中野生型和突变型基因产生的扩增片段长度不同，通过产物片段中特定条带的有无判别个体的基因型，是一种共显性分型技术，具有操作简便、分型快速、费用低廉等优势。
[0006]ARMS-PCR引物的设计是决定该技术检测灵敏度的关键，其次，ARMS-PCR对SNP检出率还依赖于反应条件的优化。
【发明内容】
[0007]本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中水稻垩白鉴别存在的技术缺陷，提供一种鉴定水稻垩白主效基因Chalk5基因型的分子标记。
[0008]本发明的第二个目的是提供上述分子标记在鉴定水稻垩白主效基因Chalk5基因型或/和垩白性状中的应用。
[0009]本发明的第三个目的是提供上述分子标记在水稻育种中的应用。
[0010]本发明的第四个目的是利用上述分子标记鉴定水稻垩白性状或同时鉴定水稻垩白性状和水稻垩白主效基因Chalk5基因型的方法。
[0011]本发明的第五个目的是利用上述分子标记鉴定水稻垩白主效基因Chalk5基因型的方法。
[0012]本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的:
一种鉴定水稻垩白主效基因Chalk5基因型的分子标记Chalk5-T/C，所述分子标记由一对外引物 Chalk5-0-F、Chalk5_0_R 和一对内引物 Chalk5_C_F、Chalk5_T_R 组成，引物序列如SEQ ID NO:1?4所示。
[0013]本发明所述分子标记是针对垩白基因的启动子SNP位点“-576-T/C”设计，该分子标记涵盖差异位点。
[0014]为了增加引物的特异性，本发明上述引物是利用在线tetra-primer ARMS-PCR引物设计工具 Primerl (http://primerl.soton.ac.uk/primerl.html)设计得到，同时，本发明所述内引物的3’端第3个碱基引入错配碱基。
[0015]提供上述分子标记在鉴定水稻垩白主效基因Chalk5基因型或/和水稻垩白性状中的应用。
[0016]提供上述分子标记在水稻育种中的应用。
[0017]提供利用上述分子标记鉴定水稻垩白主效基因Chalk5基因型的方法；具体地，该方法包括以下步骤:
SI待测样品DNA提取；
S2以SI得到的样品DNA为模板，构建PCR反应体系，利用所述分子标记进行PCR扩增；
S3利用凝胶电泳或毛细管电泳分析PCR扩增后的产物，进行结果判定，所述结果判定为:若出现196bp和298bp条带，则表明待测样品的垩白主效基因为低垩白基因型；若出现150bp和298bp条带，则表明待测样品的垩白主效基因为高垩白基因型；若出现150bp、196bp和298bp条带，则表明待测样品的垩白主效基因为杂合型。
[0018]提供利用上述分子标记鉴定水稻垩白性状或同时鉴定水稻垩白主效基因Chalk5基因型和水稻垩白性状的方法，具体地，包括以下步骤:
SI待测样品DNA提取；
S2以SI得到的样品DNA为模板，构建PCR反应体系，利用所述分子标记进行PCR扩增；
S3利用凝胶电泳或毛细管电泳分析PCR扩增后的产物，进行结果判定，所述结果判定为:若出现196bp和298bp条带，则表明待测样品的垩白主效基因为低垩白基因型，待测样品为低垩白品种；若出现150bp和298bp条带，则表明待测样品的垩白主效基因为高垩白基因型，待测样品为高垩白品种；若出现150bp、196bp和298bp条带，则表明待测样品的垩白主效基因为杂合型，待测样品为中间型品种。
[0019]ARMS-PCR检测的灵敏度除了决定于引物的特异性之外，还受到PCR反应各种条件的影响，如引物浓度、退火温度、TaqDNA聚合酶的浓度等，因此，优选地，上述方法中，所述 PCR 反应体系为:DNA 模板 1.0 uL、Chalk5_C_F 0.5uL、Chalk5_T_R 0.5uL、Chalk5_0_F
0.3uL、Chalk5_0-R 0.3uL、2XPower Taq PCR Master Mix 7.5uL，用双蒸灭菌水补足至15uL0
[0020]优选地，上述方法中，所述PCR扩增的条件为:94 °C预变性5min，94 °C 30s，55°C 30s，72°C 35s共运行35个循环，最后72°C延伸1min。
[0021]与现有技术相比，本发明具有以下有益效果:
本发明提供了一种鉴定水稻垩白主效基因Chalk5基因型的分子标记，该标记扩增片段适中、特异性强；利用该标记鉴定水稻垩白主效基因Chalk5基因型，不需要经过测序，仅仅通过简单的PCR即可对水稻垩白主效基因进行基因分型，区分高、低垩白的水稻品种，实现了对水稻垩白性状的分子标记辅助选择，本发明所述分子标记可以用于水稻改良分离群体的分子标记辅助选择，提高育种效率，满足大规模分子育种的需求。
【附图说明】
[0022]图1为Chalk5_T/C引物序列及位置示意图；其中等位变异位点分别以红色背景标识，弓I物错配碱基以下划线标识。
[0023]图2为Chalk5_T/C扩增产物的凝胶电泳分型；其中:1_明恢63 ;2_巴斯马蒂370 ；
3-珍汕 97B ；4-1R64 ;5_ 珍汕 97B/ 明恢 63。
[0024]图3为Chalk5_T/C联合全自动毛细管电泳检测结果；其中M为DNA ladder ；1?10为检测水稻材料，1、3、6为C/C型；2，8、10为T/T型；4、5、7、9为C/T型。
【具体实施方式】
[0025]下面结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的简单修改或替换，均属于本发明的范围；若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0026]实施例1水稻垩白基因功能性标记Chalk5_T/C的引物设计及扩增片段分析
1、引物设计
针对垩白基因Chalk5的启动子SNP位点“-576-T/C”( T-高垩白品种，C-低垩白品种)，利用在线 tetra-primer ARMS-PCR 引物设计工具 Primerl(http://primerl.soton.ac.uk/primerl.html)设计涵盖差异位点的功能标记Chalk5_T/C，同时在等位特异引物的3’端第3个碱基处引入错配碱基，增加特异性(图1)。所述的Chalk5-T/C由4个引物Chalk5_0_F、Chalk5-0-R、Chalk5-C-F 和 Chalk5_T_R 构成，引物序列(5’ _3’)如下:
ChaIk5-0-F:TCAAAAACCACCATTCGAAATGAChalk5-0-R:TGTGTATAAACATTTTTGTTGTTTTTGCAChalk5-C-F:CATTTTCAGTGCGTCCAAAACCChalk5-T-R:AAGTTATATACGGTGCGTCTCATGGA (引物序列中带下划线的碱基为引入的错配碱基，加框的碱基为要检测的变异碱基)
2、扩增片段分析
低垩白基因型(C/C纯合型)、高垩白基因型(T/T纯合型)和杂合型(C/T杂合型)，都能利用Chalk5-0-F和Chalk5-0-R扩增出大小约为298 bp的条带，此带可以用于PCR扩增与否的监测。此外，低垩白基因型(C/C纯合型)还能利用Chalk5-C-F和Chalk5-0-R扩增出一条196 bp的条带；高垩白基因型(T/T纯合型)能利用Chalk5-0-F和Chalk5-T-R扩增出一条150 bp的条带；杂合型(C/T杂合型)既能扩增出196 bp的条带又能扩增出150 bp的条带。
[0027]实施例2利用功能性标记Chalk5_T/C分析5个水稻品种的垩白基因型 1、水稻基因组DNA的提取
以5个水稻品种为材料:明恢63、巴斯马蒂370、珍汕97B、IR64、