一种新型耐热糖苷水解酶MtCel3及其编码序列和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物工程，具体地说是一种以嗜热毁丝菌Myceliophthora thermophila糖苷水解酶基因MtCel3表达的高效耐热糖苷水解酶MtCel3及其编码序列和 应用。 (二）
【背景技术】
[0002] 糖苷水解酶（英语：Glycoside hydrolases，又称糖苷酶）是一种专门水解配糖键 (glycosidic bond)，并产生两个较小的糖分子的酵素，也是自然界中的常见酵素之一。这 类蛋白质在人类的产业上也有所应用，例如用来将纤维素与半纤维素等生物质能降解成可 用的小分子。糖苷水解酶具有多个家族。
[0003] 嗜热毁丝菌Myceliophthora thermophila是一种广泛分布于土壤中的嗜热真菌。 该菌在微晶纤维素为唯一碳源的培养基中50°C条件下可以产生热稳定的纤维素酶和糖苷 水解酶。
[0004] 嗜热毁丝菌产生的耐热糖苷水解酶MtCel3具有很强的纤维素酶活性，可有效地 把长链纤维素分解为寡糖，目前为止尚未有关于此酶的任何报道。MtCel3对羧甲基纤维素 的水解活力尚达47. 5 lU/mg，具有很尚的纤维素水解能力。 (三）
【发明内容】
[0005] 本发明从嗜热毁丝菌Myceliophthora thermophila获得DUF4360超家族耐热糖 苷水解酶基因的cDNA序列全长，命名为MtCel3,基因cDNA全长627bp，编码208个氨基酸。 MtCel3具有信号肽序列（l-17aa MRLQALTLSLLAAAGLA)及2个N糖基化位点和3个0糖基 化位点。将MtCel3编码的氨基酸序列在国际基因库中进行检索，尚未发现相关报道。
[0006] 构建重组表达质粒载体pPIC9K/MtCel3,利用电转仪进行电击转化Pichia pastoris GS115,在MD和丽培养基上筛选，经PCR鉴定筛选阳性转化子，G418筛选多拷贝 转化子，然后进行甲醇诱导表达，获得毕赤酵母工程菌株GS-MT-Cel3。该工程菌株接种于 含BMGY培养基中，在28°C 200rpm/min摇床培养6d后，糖苷水解酶的表达量为3. 8mg/ml， 分子量为27. 2KDa，对羧甲基纤维素的水解活力高达47. 51U/mg，对微晶纤维素的水解活力 为4. 33U/mg，MtCel3在60°C下是稳定的，处理lh后仍有95%以上的酶活性；70°C处理lh 后仍保持78%的活性；80°C处理lh后保持25%的活性；90°C处理lh后保持8%。
[0007] 耐热糖苷水解酶MtCel3对长链纤维素具有很强的水解能力，其对羧甲基纤维素 的水解活力高达47. 51U/mg，对微晶纤维素的水解活力为4. 33U/mg，对脱脂棉的水解活性 为12. 21U/mg，对滤纸的水解活性为8. 82U/mg。并且MtCel3有很好的热稳定性，在70°C的 处理lh条件下仍可以保持78%的活性，具有很好的工业应用前景。 (四）
【附图说明】
[0008] 图1耐热糖苷水解酶MtCel3的SDS-PAGE分析
[0009] 泳道1 :低分子量蛋白标准
[0010] 泳道2 :纯化的耐热糖苷水解酶MtCel3 [0011]图2A:耐热糖苷水解酶MtCel3的最适温度
[0012] B:耐热糖苷水解酶MtCel3的热稳定性测定
[0013] 图3耐热糖苷水解酶MtCel3的最适pH
[0014] 图4耐热糖苷水解酶MtCe 13水解羧甲基纤维素产物的TLC分析
[0015] 泳道1 :标准寡糖（DP2-DP7)
[0016] 泳道2:水解羧甲基产物 (五）【具体实施方式】
[0017] 实施例1 :嗜热毁丝菌Myceliophthora thermophila的分离鉴定
[0018] (1)标本采集：从堆肥中采集。
[0019](2)分离培养：将采集标本取0. 5克放置在PDA平板上50°C培养3天后，进行分离 纯化。操作步骤参考Cooney and Emerson (1964)文献。
[0020] (3)鉴定：参考Cooney and Emerson(1964)和LaTouche(1950)文献。
[0021] 实施例2 :耐热糖苷水解酶基因MtCel3的克隆
[0022](1)嗜热毁丝菌Myceliophthora thermophila总 RNA 的提取：参照Trizol试剂 盒说明。
[0023] (2) cDNA 第一条链的合成：按照 Takara 公司的 TaKaRa RNA PCR kit (AMV) Ver3. 0 试剂盒说明书进行：取1~2 y g总RNA，加RNase Free ddH20至9. 5 y L，将RNA样品在75°C 变性5 m i n，立即在冰浴中冷却5 m i n，然后稍微离心一下，在冰浴中依次加入以下各种成 分：10mmol/L dNTP Mixture 2yL，10XRT BufTer(Mg2+)2yL，25mmol/L MgCl24yL，Oligo d (T)-Adaptor Primer 1 y L, RNase Inhibiter 0.5 y L, AMV Reverse Transcriptase 1 y L(Final Volume 20 y L)，将反应液混合后，室温下放10min，然后42°C温育60min，再煮 沸5min以灭活反转录酶。加入180 y L DEPC处理的ddH20,稀释至200 y L，混勾，稍微离心， 保存于-20 °C，备用。
[0024] (3)PCR反应（25yL) :cDNA 2yL，lOXBuffer 2. 5yL，10mmol/L dNTP2yL， 25臟〇1/11%(：1221^，上、下游引物各21^，了39〇嫩聚合酶0.5 1^(5。/1^)，(1(1112012 1^。 反应条件为94°C 5min预变性；94°C 40s，52°C 40s，72°C lmin，共32个循环，72°C延伸 10min，4°C保存。
[0025] 上游引物：5 ' -ATGAGACTCCAAGCCCTGAC-3 '
[0026] 下游引物：5 ' -CTACTCATCCITTGCGATCAC-3 '
[0027] (4)基因克隆：取0.5ylPCR产物与pMD18-T载体进行连接，操作步骤按照 TAKARA公司产品说明书进行。然后连接产物转化大肠杆菌DH5a菌株，在表面涂有氨卞青 霉素（100 Ug/mL)的LB平板上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基中培养过夜。
[0028] (5)质粒DNA的提取：碱法提取质粒DNA。
[0029] (6)序列测定：DNA双脱氧法测定核苷酸序列，在上海生物工程有限公司进行。序 列引物为M13启动子引物。嗜热毁丝菌MtCel3基因cDNA全长627bp，包含起始密码子和终 止密码子，无内含子，编码208个氨基酸。将此氨基酸序列在国际基因库中进行检索，尚未 发现报道。该序列如下：
[0030] (A)SEQ ID NO 1 的信息
[0031] (a)序列特征：*长度：627碱基对；*类型：核酸；*链型：双链；*拓扑结构：线性
[0032] (b)分子类型：DNA
[0033] (c)假设：否
[0034] ⑷反义：否
[0035] (e)最初来源：嗜热毁丝菌 Myceliophthora thermophila
[0036] (f)序列描述：
【主权项】
1. 一种新型嗜热毁丝菌（Myceliophthorathermo地ila)糖巧水解酶化Cel3及其编 码序列和应用，其特征是该水解酶是一种尚未报道的热稳定内切糖巧水解酶，具有良好的 纤维素酶活性。通过RT-PCR方法从嗜热毁丝菌获得糖巧水解酶基因MtCel3,将该基因克 隆到毕赤酵母分泌型表达载体PPIC9K，获得表达重组质粒pPIC9K/MtCel3,转化毕赤酵母 GS115,从中筛选出表达热稳定糖巧水解酶基因化Cel3的毕赤酵母工程菌株GS-MT-Cel3， 其表达产生的糖巧水解酶化Cel3对纤维素具有很高的内切水解酶活性；其中，所述嗜热毁 丝菌糖巧水解酶化Cel3核巧酸序列如SEQIDNO. 1所示。 注意事项 一、 申请发明专巧或者实用新型专利应当提交权利要求书，一式一份。 二、权利要求书应当打宇或者印刷，字迹应当整齐清晰，呈黑色，符合制版要求，不得涂改，字高应当在 3. 5毫米至4. 5毫米么间，巧距应当在2. 5毫米至3. 5毫米之间，权利要求书首页用此页，续页可使 用同样大小和质量相当的白纸。纸张应当缴向使用，只限使用正面，四周应当留有页边距：左侧和顶 部各巧毫米，右侧和底部各15毫米。 S、权利要求书应当说明发明或者实用新型的技术特征，清楚和简要地表述请求保护的范围。权利要求书 有几项权刹要求时，应当用阿拉化数字顺序编号.菊号前不得冠W"权利要求"或者"权项"等词。 四、 权利要求书中使用的科技术语应当与说明书中使用的一致，可W有化学式或者数学式，必要时可W有 表格，但不得有插图。不得使用"如说明书……部分巧述"或者"如图……巧示"等用语。 五、 每一硕权利度求仅允许在权利巧求的结展化使用句号。 六、 权不0要求书应当巧毎页下框线居中位置顺序编写页码。
【专利摘要】本发明是一种新型热稳定的嗜热毁丝菌Myceliophthora thermophila糖苷水解酶MtCel3及其编码序列和应用。通过RT-PCR方法从嗜热毁丝菌Myceliophthora thermophila中获得糖苷水解酶基因MtCel3，将其克隆并插入到毕赤酵母整合表达载体pPIC9K中，然后将得到的糖苷水解酶基因MtCel3表达载体pPIC9K/MtCel3导入到毕赤酵母GS115中，再从中筛选出一种表达糖苷水解酶基因MtCel3的酵母工程菌GS-MT-Cel3其表达产生的糖苷水解酶MtCel3对纤维素具有很高的内切水解酶活性。MtCel3具有良好的热稳定性和很强的水解纤维素能力，可广泛用于纤维废料及其它工业领域，具有重大经济价值和社会价值。
【IPC分类】C12N15-81, C12N15-56, C12N9-42, C12R1-84
【公开号】CN104789580
【申请号】CN201510222269
【发明人】李多川, 韩超, 陈宸
【申请人】山东农业大学
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2015年5月5日