一种家蚕质型多角体病毒的体外构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于病毒基因工程领域，具体涉及一种家蚕质型多角体病毒的体外构建方 法。
【背景技术】
[0002] 呼肠孤病毒科（Reoviridae)病毒是一类能感染动物、植物以及真菌的双链RNA (dsRNA)病毒。质型多角体病毒（Cytoplasmic polyhedrosis virus，简称CPVs)是呼肠孤 病毒科质型多角体病毒属（Cypovirus)中的成员，其基因组由9至11个双链RNA片段组成。 CPVs是农林害虫的重要病原，能感染鳞翅目（Ze/?i￡/o/7te_ra)、膜翅目（办膨和鞘翅 目（Cbhoptera)昆虫，在害虫自然种群控制方面发挥重要的作用，是一种极具开发潜力的 生物杀虫剂。
[0003] 根据CPVs基因组dsRNA在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迀移模式，CPVs可分为20 种不同的类型。家香质型多角体病毒（及咖cytoplasmic polyhedrosis virus， BmCPV)是CPV1型中的典型种，能感染家蚕中肠细胞，导致家蚕发生质型多角体病，进而引 起养蚕歉收。家蚕质型多角体病毒基因组由S1至S10共计10个双链RNA片段组成，各个 片段的序列业已明确。
[0004] 通常，获取家蚕质型多角体病毒的方法是从自然发生的或人工感染的患质型多角 体病的家蚕中肠中提纯，但这种方法必须利用家蚕这一宿主。另外，家蚕质型多角体病毒的 基因组为分节段的双链RNA病毒，利用常规的遗传操作技术难以对家蚕质型多角体病毒基 因组进行改造，进而获得重组病毒，从而导致CPVs基因组各片段的功能研宄进展缓慢，也 无法获得重组CPVs杀虫剂。
[0005] 到目前为止，未见体外构建家蚕质型多角体病毒的报道。因此，开发家蚕质型多角 体病毒基因组双链RNA片段的遗传操作技术，建立家蚕质型多角体病毒的体外构建方法， 不但对于家蚕质型多角体病毒基因组各片段的功能研宄具有促进作用，而且也可以为重组 CPVs生物杀虫剂的研发提供理论指导和技术支撑。
【发明内容】
[0006] 针对上述情况，本发明的目的在于提供一种家蚕质型多角体病毒的体外构建方法 以及所使用的引物。
[0007] 为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下所述： 一种家蚕质型多角体病毒的体外构建方法，其包括下列步骤： (1) 获得家蚕质型多角体病毒基因组； (2) 根据家蚕质型多角体病毒基因组Sl、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10片段的双 链 RNA 的末端序列，设计并合成 10 对引物：PS1F/PS1R、PS2F/PS2R、PS3F/PS3R、PS4F/PS4R、 PS5F/PS5R、PS6F/PS6R、PS7F/PS7R、PS8F/PS8R、PS9F/PS9R、PS10F/PS10R，其中所述引物的 编号情况如下： 引物 PS1F 对应 SEQ ID N0:1，引物 PS1R 对应 SEQ ID N0:2， 引物卩52卩对应5￡〇10勵:3，引物卩521?对应5￡〇10勵:4， 引物 PS3F 对应 SEQ ID NO: 5,引物 PS3R 对应 SEQ ID NO:6， 引物 PS4F 对应 SEQ ID NO: 7,引物 PS4R 对应 SEQ ID NO:8， 引物 PS5F 对应 SEQ ID NO:9,引物 PS5R 对应 SEQ ID NO: 10， 引物 PS6F 对应 SEQ ID NO: 11，引物 PS6R 对应 SEQ ID NO: 12， 引物 PS7F 对应 SEQ ID NO: 13,引物 PS7R 对应 SEQ ID NO: 14， 引物 PS8F 对应 SEQ ID NO: 15,引物 PS8R 对应 SEQ ID NO: 16， 引物 PS9F 对应 SEQ ID NO: 17,引物 PS9R 对应 SEQ ID NO: 18， 引物？51(^对应5￡〇10勵：19，引物卩5101?对应5￡〇10勵：20， 各个引物的序列如下所示：
【主权项】
1. 一种家蚕质型多角体病毒的体外构建方法，其包括下列步骤： 1) 获得家蚕质型多角体病毒基因组； 2) 根据家蚕质型多角体病毒基因组Sl、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、SlO片段的双 链RNA的末端序列，设计并合成 10 对引物：PS1F/PS1R、PS2F/PS2R、PS3F/PS3R、PS4F/PS4R、 PS5F/PS5R、PS6F/PS6R、PS7F/PS7R、PS8F/PS8R、PS9F/PS9R、PS10F/PS10R，其中所述引物的 编号情况如下： 引物 PSlF 对应SEQIDNO: 1，引物 PSlR对应SEQIDNO:2， 引物 PS2F 对应SEQIDNO: 3,引物 PS2R对应SEQIDNO:4， 引物 PS3F 对应SEQIDNO: 5,引物 PS3R对应SEQIDNO:6， 引物 PS4F 对应SEQIDNO: 7,引物 PS4R对应SEQIDNO:8， 引物PS5F对应SEQIDNO:9,引物PS5R对应SEQIDNO: 10， 引物PS6F 对应SEQIDNO: 11，引物PS6R对应SEQIDNO: 12， 引物PS7F 对应SEQIDNO: 13,引物PS7R对应SEQIDNO: 14， 引物PS8F 对应SEQIDNO: 15,引物PS8R对应SEQIDNO: 16， 引物PS9F 对应SEQIDNO: 17,引物PS9R对应SEQIDNO: 18， 引物PSlOF对应SEQIDNO: 19,引物PSlOR对应SEQIDN0:20， 所述引物的核苷酸序列如SEQIDNO: 1至SEQIDNO:20所示； 3) 获得Sl至SlO片段的cDNA; 4) 分别以步骤3)中获得的Sl至SlO片段的cDNA为模板，对应使用步骤2)中合成的 10对引物进行PCR扩增，获得Sl至SlO片段全长cDNA的扩增产物； 5) 将步骤4)中获得的Sl至SlO片段全长cDNA的扩增产物分别使用限制性内切酶进 行酶切，然后克隆到质粒载体中，获得分别带有Sl至SlO片段全长cDNA的重组质粒pT-Sl、 pT-S2、pT-S3、pT-S4、pT-S5、pT-S6、pT-S7、pT-S8、pT-S9、pT-S10,其中所述限制性内切酶 的使用情况如下： Sl片段全长cDNA的扩增产物用5^1和fecll进行酶切； S2片段全长cDNA的扩增产物用5^1和fecll进行酶切； S3片段全长cDNA的扩增产物用5^1和fecll进行酶切； S4片段全长cDNA的扩增产物用如M和fecll进行酶切； S5片段全长cDNA的扩增产物用办7/?1和fecll进行酶切； S6片段全长cDNA的扩增产物用办7/?1和fecll进行酶切； S7片段全长cDNA的扩增产物用办ml和ZhI进行酶切； S8片段全长cDNA的扩增产物用办7/?1和fecll进行酶切； S9片段全长cDNA的扩增产物用办7/?1和fecll进行酶切； SlO片段全长cDNA的扩增产物用办7/?1和fecll进行酶切； 6) 将步骤5)中获得的pT-Sl至pT-SlO重组质粒分别使用限制性内切酶进行酶切、线 性化后，作为模板备用，经过体外转录，获得Sl至SlO片段的RNA，其中所述限制性内切酶的 使用情况如下： 重组质粒PT-Sl用fecll进行酶切； 重组质粒PT-S2用fecll进行酶切； 重组质粒PT-S3用fecll进行酶切； 重组质粒PT-S4用fecll进行酶切； 重组质粒PT-S5用fecll进行酶切； 重组质粒PT-S6用fecll进行酶切； 重组质粒PT-S7用油al进行酶切； 重组质粒PT-S8用fecll进行酶切； 重组质粒PT-S9用fecll进行酶切； 重组质粒PT-SlO用fecll进行酶切； 7)将步骤6)中获得的Sl至SlO片段的RNA等摩尔混合，使用脂质体进行包裹并转染 宿主，待观察到宿主的细胞质内形成大量多角体时，收集细胞并破碎，离心纯化，获得体外 构建的家蚕质型多角体病毒。
2. 根据权利要求1所述的家蚕质型多角体病毒的体外构建方法，其特征在于，步骤1) 中所述家蚕质型多角体病毒基因组的获得采用实验室提取或者商业购买的方法来实现。
3. 根据权利要求2所述的家蚕质型多角体病毒的体外构建方法，其特征在于，在实验 室提取的情况下，从家蚕质型多角体病毒粒子或家蚕质型多角体中提取病毒基因组，优选 从家蚕质型多角体中提取病毒基因组。
4. 根据权利要求1所述的家蚕质型多角体病毒的体外构建方法，其特征在于，步骤3) 中所述Sl至SlO片段的cDNA的获得采用基于RNA序列的全人工合成或反转录的方法来实 现。
5. 根据权利要求4所述的家蚕质型多角体病毒的体外构建方法，其特征在于，在反转 录的情况下，将步骤1)中获得的家蚕质型多角体病毒基因组于l〇〇°C煮沸10分钟，再冰浴2 分钟后，作为模板备用，分别使用步骤2)中合成的引物PS1R、PS2R、PS3R、PS4R、PS5R、PS6R、 PS7R、PS8R、PS9R、PSlOR进行反转录，对应获得SI至SlO片段的cDNA。
6. 根据权利要求1所述的家蚕质型多角体病毒的体外构建方法，其特征在于，步骤5) 中所述质粒载体选自pIZT-V5/His载体、pUC系列载体、pBlueScriptSKII载体中的任意 一种，优选pIZT-V5/His载体。
7. 根据权利要求1所述的家蚕质型多角体病毒的体外构建方法，其特征在于，步骤6) 中用于体外转录的模板是步骤5)中获得的重组质粒pT-Sl至pT-SlO或者是以步骤5)中 获得的重组质粒PT-Sl至pT-SlO为模板，对应使用步骤2)中合成的10对引物进行PCR扩 增后获得的扩增产物。
8. 根据权利要求1所述的家蚕质型多角体病毒的体外构建方法，其特征在于，步骤7) 中所述脂质体为Lipofectamine2000。
9. 根据权利要求1所述的家蚕质型多角体病毒的体外构建方法，其特征在于，步骤7) 中所述宿主是家蚕或家蚕培养细胞，优选家蚕培养细胞，更优选家蚕BmN培养细胞。
10. 用于上述权利要求中任一项所述的家蚕质型多角体病毒的体外构建方法的10对 引物，所述引物的核苷酸序列如SEQIDNO: 1至SEQIDNO:20所示。
【专利摘要】本发明公开了一种家蚕质型多角体病毒的体外构建方法。具体而言，本发明的方法包括下列步骤：1）获得家蚕质型多角体病毒基因组；2）设计并合成引物；3）获得病毒基因组S1至S10片段的cDNA；4）对cDNA进行PCR扩增；5）将扩增产物进行酶切，然后克隆到质粒载体中，获得重组质粒；6）将重组质粒进行酶切、线性化后，经过体外转录，获得RNA；以及7）将RNA等摩尔混合，使用脂质体进行包裹并转染宿主，进而获得体外构建的家蚕质型多角体病毒。本发明的家蚕质型多角体病毒的体外构建方法不但对家蚕质型多角体病毒基因组各片段的功能研究有促进作用，也可以为重组质型多角体病毒生物杀虫剂的研发提供技术支持。
【IPC分类】C12N15-11, C12N15-88, C12R1-93, C12N15-46, C12N7-00
【公开号】CN104789597
【申请号】CN201510209183
【发明人】贡成良, 薛仁宇, 曹广力, 胡小龙, 郭睿
【申请人】苏州大学
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2015年4月28日