酵母中生产乙酰-CoA的酶的制作方法
【专利说明】
[0001]本申请是申请号为200880100320. 7的中国专利申请的分案申请，原申请是国际 申请PCT/EP2008/059119的中国国家阶段申请。
技术领域
[0002] 本发明属于使用异源表达体系在酵母中生产代谢产物的领域。具体地，本发明涉 及对下述酵母菌株的代谢改造，所述酵母菌株能够生产需要胞质乙酰-CoA作为前体的代 谢产物，例如生产丁醇的酵母菌株。本发明涉及鉴定异源酶的实验体系，所述异源酶在酵母 胞质中表达时能够将丙酮酸、乙醛或乙酸转化为乙酰-CoA。
【背景技术】
[0003] 乙酰-辅酶A(C〇A)是大量代谢通路的必需中间产物，并且是许多工业相关化合物 合成中的关键前体，所述化合物例如为脂肪酸、类胡萝卜素、类异戊二烯、维生素、氨基酸、 脂质、蜡酯、（多）糖多羟基链烷酸酯、他汀、聚酮化合物和乙酸酯（例如乙酸乙酯和乙酸异 戊酯）。具体地，乙酰-CoA也是工业上重要的大量使用的化学品1- 丁醇的前体。
[0004] 与细菌例如E. coli相比，酵母细胞提供了生产上述乙酰-CoA衍生产物的非常合 适的替代方式，原因是因为基于酵母的过程可以在低pH下运行，所以酵母对噬菌体或其它 感染不易感。因此，使用酵母不需要无菌的过程，从而降低了感兴趣的产物的成本价格。
[0005] 当天然（野生型）酵母不能够生产感兴趣的乙酰-CoA衍生产物时，使用代谢工 程改造能够提供表达能够支持这类过程的异源基因的酵母细胞。在这类情况下，异源基 因产物通常被靶向酵母的胞质区室。因为乙酰-CoA-衍生产物的生物合成会完全或部分 地在胞质溶胶中进行，所以在胞质区室中供应足量的前体乙酰-CoA是至关重要的。在 Saccharomyces cerevisiae中，乙酰-CoA的生物合成发生于两个分开的区室中。在线粒体 中，通过丙酮酸脱氢酶复合物（PDH)催化的丙酮酸氧化脱羧作用合成乙酰-CoA，该合成具 有以下的总反应化学计量：
[0006]丙酮酸（Pyr) +CoA+NAD+=乙酰-C〇A+C0 2+NADH+H+
[0007] 在胞质溶胶中，通过丙酮酸脱氢酶（PDH)旁路合成乙酰-CoA，该旁路涉及酶丙酮 酸脱羧酶（PDC)、乙醛脱氢酶（ALD)和乙酰-CoA合成酶（ACS)，其具有以下的总体反应化学 计量：
[0008] Pyr+CoA+ATP+NAD (P) + =乙酰-C〇A+C0 2+NAD (P) H+AMP+PP i +H+。
[0009] 酵母S. cerevisiae的丙酮酸-脱氢酶-负性（Pdc_)突变体不具有功能性PDH旁 路，并且由于不能为生长提供（足量的）胞质乙酰-CoA而不能在含葡萄糖作为唯一碳源的 最小培养基上生长（Flikweert et al.，（1996)Yeastl2:247-57)。因此，PDH旁路对在胞质 区室中提供乙酰-CoA而言是必需的。然而，从以下的总体反应化学计量中可以看出，对能 量平衡而言酵母中的PDH旁路不是最适的：通过H)H-旁路合成每摩尔乙酰-CoA需要2摩 尔ATP，因为乙酰-CoA合成酶反应ATP被水解为AMP。相反，经由PDH的线粒体通路不需要 ATP。PDH旁路的额外ATP需求可能是从胞质乙酰-CoA前体合成感兴趣的产物的一个问题， 因为为了产生ATP需要通过例如氧化磷酸化和/或底物磷酸化（例如糖酵解）将更多的碳 源转化，从而降低基于碳的产物总体产率。
[0010] 将酵母代谢工程改造为生产1-丁醇时，可以在酵母细胞的胞质溶胶中表达异源 生物合成基因（W0 2007/041269)。通常，1摩尔葡萄糖通过糖酵解产生2摩尔乙酰-CoA，这 是1摩尔丁醇的前体；因此，如果不考虑细胞生长和维持，则每摩尔葡萄糖最多能够合成1 摩尔丁醇。然而，与丁醇生物合成组合使用TOH旁路时，由于能量不平衡而不能达到该最大 理论产率：其中在糖酵解中每摩尔转化的葡萄糖产生2摩尔ATP，PDH旁路中形成2摩尔乙 酰-CoA需要总计4摩尔（2乘以2摩尔）ATP，所述2摩尔乙酰-CoA被转化为1摩尔丁醇。 因此，如果使用PDH旁路从1摩尔葡萄糖中合成1摩尔1- 丁醇，则存在ATP的净短缺。
[0011] 因此，需要鉴定出其中不需要PDH旁路的可能替代性代谢途径，用于在酵母中生 产胞质乙酰-CoA，用于生产乙酰-CoA衍生产物，尤其是丁醇。
[0012] 丁醇是重要的工业化学品，并且适合用作替代性的引擎燃料，其具有优于乙醇的 改进的特性。丁醇还可用作多种化学和纺织过程的溶剂，用于塑料的有机合成中，用作化学 中间产物，和在涂层和食品和调味剂工业中用作溶剂。丁醇可以产自生物质（生物丁醇） 以及化石燃料（石油丁醇）。
[0013] 可以通过本领域已知的多种可用方法完成丁醇异构体之一的化学 合成（见例 如 Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry,6th edition,2003, ffiley-VCHVerlag GmbH and Co., ffeinheim, Germany, Vol. 5, pp. 716-719) 〇 这些工艺的缺点是它们基于石油化学品衍生物的使用，所述石油化学品衍生物通常是昂贵 的并且对环境不友好。
[0014] 可以使用细菌Clostridium acetobutylicum或其它Clostridium物种进行的丙 酮-丁醇-乙醇（ABE)过程，通过发酵实现丁醇的生物合成。然而，ABE过程的一个重要缺 点在于，其产生丙酮、1-丁醇和乙醇的混合物。另外，细菌的使用需要无菌的工艺条件，并通 常使该过程对噬菌体感染易感。因此，酵母细胞提供了上文所述的非常合适的替代方式。
【发明内容】
[0015] 本发明人目前鉴定了在酵母中提高胞质乙酰-CoA生产的替代性代谢途径，所述 途径能够克服PDH旁路的问题。
[0016] 一种可能的途径包括通过使用乙酰基化乙醛脱氢酶（E. C. 1. 2. 1. 10)(见图2,反 应A，A⑶H)将乙醛直接转化为乙酰-CoA而不消耗ATP。另一途径包括通过酶或多酶复合物， 例如通过使用丙酮酸：NADP氧化还原酶（E. C. 1.2. 1.51)(见图2,反应C，PN0)，将丙酮酸直 接转化为乙酰-CoA而不消耗ATP。在这两种可能的途径中，每摩尔葡萄糖形成1摩尔丁醇会 导致形成2摩尔ATP。还有另一种途径包括通过替代性酶或酶组合，例如通过使用乙酸：CoA 连接酶（ADP-形成，E. C. 6. 2. 1. 13)，或通过使用ATP:乙酸磷酸转移酶（E. C. 2. 7. 2. 1)与 乙酰-CoA:Pi乙酰基转移酶（E. C. 2. 3. 1.8)组合，将乙酸转化为乙酰-CoA，形成每个乙 酰-CoA消耗1个ATP。在该途径中，每摩尔葡萄糖形成1摩尔丁醇是ATP-平衡的，即不会 形成ATP。本发明人目前发现，PDH旁路的这一替代方式可以在酵母的胞质溶胶中导致乙 酰-CoA合成，并且这样的乙酰-CoA可以在生物合成中用于产生更高量的想要的发酵产物， 例如丁醇。
[0017] 在第一方面，本发明提供了鉴定下述异源多肽的方法，所述多肽具有在酵母细胞 (的胞质溶胶）中将丙酮酸、乙醛或乙酸转化为乙酰-CoA的酶活性，所述方法包括：
[0018] -提供突变的酵母细胞，其中所述突变包括至少一种（PDH)旁路基因的失活，所述 基因选自编码丙酮酸脱羧酶（PDC)、乙醛脱氢酶（ALD)和乙酰-CoA合成酶（ACS)的基因；
[0019]-用包含至少一种异源核苷酸序列的表达载体转化所述突变的酵母细胞，所述异 源核苷酸序列与在酵母中有功能的启动子可操作地连接，并且所述异源核苷酸序列编码至 少一种具有将丙酮酸、乙醛或乙酸转化为乙酰-CoA的潜在酶活性的候选多肽；
[0020] -针对在含葡萄糖作为唯一碳源的最小培养基上生长的能力，测试所述重组突变 的酵母细胞，和
[0021] -当观察到所述细胞的生长时，将所述候选多肽鉴定为具有在所述酵母细胞（的 胞质溶胶）中将丙酮酸、乙醛或乙酸转化为乙酰-CoA的酶活性的异源多肽。
[0022] 在所述方法的一个优选的实施方案中，酵母细胞是Saccharomyces cerevisiae 细胞，针对在Saccharomyces cerevisiae中的表达，对所述异源核苷酸序列进行了密码子 (对）优化。
[0023] 在另一个优选的实施方案中，所述突变包括乙酰-CoA合成酶同种型2 (acs2)基因 的失活。
[0024] 在另一个优选的实施方案中，所述具有将乙醛转化为乙酰-CoA的酶活性的至少 一种候选多肽是（推定的）乙酰基化乙醛脱氢酶。
[0025] 或者，所述在酵母细胞（的胞质溶胶）中具有将丙酮酸、乙醛或乙酸转化为乙 酰-CoA的酶活性的至少一种异源多肽可以由两种或更多酶组成，所述两种或更多酶一起 发挥作用，达到想要的从丙酮酸、乙醛或乙酸到乙酰-CoA的转化。
[0026] 在另一方面，本发明提供了用于在酵母细胞基因组中整合异源核苷酸序列并随后 从中表达异源多肽的整合载体，所述异源核苷酸序列编码具有将丙酮酸、乙醛或乙酸转化 为乙酰-CoA的酶活性的多肽。
[0027] 在另一方面，本发明提供了在酵母中表达异源多肽的表达载体，所述表达载体包 含异源核苷酸序列，所述异源核苷酸序列与在酵母中有功能的启动子可操作地连接并且编 码下述多肽，所述多肽在所述酵母细胞（的胞质溶胶）中具有将丙酮酸、乙醛或乙酸转化为 乙酰-CoA的酶活性。
[0028] 在所述载体的一个优选的实施方案中，通过上文所述的根据本发明的方法，鉴定 具有将丙酮酸、乙醛或乙酸转化为乙酰-CoA的酶活性的多肽。
[0029] 在另一个优选的实施方案中，所述多肽选自SEQ ID勵:19、22、25、28和52及其功 能性同源物。
[0030] 在另一个优选的实施方案中，所述表达载体用于在Saccharomyces cerevisiae 中 的表达，其中针对在Saccharomyces cerevisiae中的表达，对所述异源核苷酸序列进行了 密码子（对）优化。
[0031] 在另一个优选的实施方案中，所述异源核苷酸序列选自SEQ ID N0:20、23、26和 29 〇
[0032] 在另一方面中，本发明提供了包含如上所述本发明的表达载体的重组酵母细胞。
[0033] 在一个优选的实施方案中，重组酵母细胞还包含至少一个（PDH)旁路基因的失 活，所述基因选自编码丙酮酸脱羧酶（PDC)、乙醛脱氢酶（ALD)和乙酰-CoA合成酶（ACS)的 基因。
[0034] 优选地，根据本发明的酵母细胞包含编码乙酰-CoA合酶的基因的失活。
[0035] 在另一个优选的实施方案中，重组酵母细胞还包含下述基因（核苷酸序列）的失 活，所述基因编码能够催化乙醛转化为乙醇的酶，所述基因优选是编码醇脱氢酶的基因。
[0036] 在本文中使用时，可以通过编码酶的基因或核苷酸序列（的部分）的突变、缺失或 断裂，实现编码酶的基因（核苷酸序列）的失活。
[0037] 优选地，根据本发明的酵母细胞显示在含有葡萄糖作为唯一碳源的最小培养基上 生长。
[0038] 在本发明酵母细胞的另一个优选的实施方案中，所述酵母细胞还包含一个或多 个引入的基因，所述基因编码从胞质乙酰-CoA形成1- 丁醇的重组通路。从乙酰-CoA到 1-丁醇的合适的重组通路是本领域已知的。这类通路例如从W0 2007/041269中已知。优 选地，所述一个或多个引入的基因编码生产乙酰乙酰基-C〇A、3-羟基丁酰基-CoA、丁烯酰 基-CoA、丁酰基-CoA、丁醛和/或1- 丁醇的酶。所述酶可以是：
[0039]-乙酰-CoA 乙酰基转移酶（E. C. 2. 3. 1. 9 [Enzyme Nomenclature 1992, Academic Press，San Diego];尽管具有更宽泛的底物范围的酶（E. C. 2. 3. 1. 16)也同样有作用），所 述酶将2摩尔乙酰-Coa转化为乙酰乙酰基-CoA ;
[0040] -NADH-依赖性或NADPH-依赖性3-羟基丁酰基-CoA脱氢酶（E. C. 1. 1. 1. 35或 E.C. 1. 1. 1.30,分别为E.C. 1. 1. 1. 157或E.C. 1. 1. 1.36)，所述酶将乙酰乙酰基-CoA转化为 3-羟基丁酰基-CoA ;
[0041]-3-羟基丁酰基-CoA脱氢酶（也称作巴豆酸酶；E. C. 4. 2. 1. 17或E. C. 4. 2. 1. 55)， 其将3-羟基丁酰基-CoA转化为丁烯酰基-CoA ;
[0042] -NADH-依赖性或NADPH-依