一种用于胚胎发育质量评估的试剂盒和使用方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于医疗检测技术领域，具体涉及一种用于胚胎发育质量评估的试剂盒和 使用方法。
【背景技术】
[0002] 胚胎质量评估方法的优劣直接关系到辅助生殖临床妊娠结局的好坏。目前，在胚 胎质量评估方法中，应用最广泛的是对配子胚胎各时期的形态特征进行评分的形态学评价 法。主要通过观察胚胎的发育与碎片化等指标进行评价，缺乏客观的评价指标。
[0003] 文献"精子RNA的研宄进展"（《癌变?畸变?突变》，2011第23卷，第5期）公开 了精子RNA在精子的运动、获能、受精和胚胎发育等过程中起着非常重要的作用。精子RNA 可以作为衡量精子质量、预测精子受精能力的一个重要指标，同时，能够影响受精后胚胎的 发育，对早期胚胎发育起到重要作用。
[0004] 通过基因芯片等技术，国外文献"Human reproduction update"（Human R印rodtion Update，2013 19(6) 602-24)报导了通过检测精子中的RNA分子检测弱 精子症、畸形精子症等精子形态与活动度的异常。目前已知的标记物如PRM1、TSSK6、 miRNA-Let-7d等的差异表达可用于区分精子运动异常。尽管精子的转录本中可以检测到近 3000个RNA分子，然而，目前还没有通过芯片筛选找到可靠的基因指标，是否有单个RNA分 子可以作为胚胎发育的指标仍然不清楚，还不能从精子RNA中找到表达具体的RNA分子并 证实其对胚胎发育的作用。
【发明内容】
[0005] 针对现有的辅助生殖技术对胚胎发育缺乏客观评价指标的问题，本发明提供了一 种用于胚胎发育质量评估的试剂盒和使用方法。临床通过精子的分子标记物长非编码RNA 分子LA16c390E6. 5 (Ensembl数据库，基因登录号：ENSG00000261641)能准确的预测胚胎 发育的潜能，并对疗效检测与辅助生殖方式的选择有指导意义。
[0006] 为了实现上述发明目的，本发明采用如下的技术方案： 一种用于胚胎发育质量评估的试剂盒和使用方法，其特征在于：用于测定精子长非编 码RNA分子LA16c390E6. 5的不同表达水平的生物标志物检测试剂，通过LA16c390E6. 5的 表达水平评估胚胎发育质量；所述LA16c390E6. 5的基因序列为：SEQID N0:1。
[0007] 本发明通过在原因不明的胚胎发育停止的精子样本中通过长非编码RNA与mRNA 的芯片，筛选出在胚胎发育停止的精子样本中差异表达的一个精子表达的长非编码RNA - LA16c390E6. 5。在收集的胚胎质量低下的精子样本中通过检测LA16c390E6. 5表达量，证实 其可以有效的预测第三代试管婴儿产生的胚胎的优质胚胎的百分比。
[0008] 本发明所述的试剂盒包括阳性对照品、反转录体系、荧光定量PCR反应体系、SYBR Green试剂和LA16c390E6. 5特异性引物探针。
[0009] 本发明所述的阳性对照品为正常精子样本的阳性RNA提取的CDNA。
[0010] 优选地，所述LA16c390E6. 5的特异性引物探针， 上游引物为（SEQID N0:2) :CTCAACATCACAGCACAGGG ; 下游引物为（SEQID N0:3) :AGCTGCTTGGCCTCAmTC。
[0011] 上述引物为特异的针对LA16C390E6. 5的荧光探针，通过荧光定量PCR的原理，特 异的扩增出针对该长非编码RNA的相对于管家基因（actin)的相对表达量。
[0012] 本发明所述的胚胎发育质量评估试剂盒的使用方法，步骤如下： A、 RNA提取：采用RNA抽提试剂提取精液样本中的RNA ; B、 荧光定量PCR :对提取到的RNA进行反转录成cDNA，取cDNA为模板，采用SYBR Green 染料法进行实时荧光定量PCR分析，检测受试样本与对照品的Ct值； C、 结果分析：将检测值采用2-AACt方法换算成相对表达量。
[0013] 本发明通过基因表达芯片和长非编码芯片（ArrayStar长非编码基因芯片系统)， 筛选出在正常胚胎与低质量胚胎的男性精子样本中差异表达最显著的长非编码RNA分子 LA16c390E6. 5,并通过扩大样本得到了验证。有益效果在于： 1、目前的胚胎质量评估方法无法做到定量地对胚胎发育进行客观评价，本发明试剂盒 从精子的非编码RNA的表达量入手，检测所需的样本量少，速度快，时间短，对预测胚胎的 发育潜能的特异性高，检测方法标准化，易于临床推广。
[0014] 2、本发明首次提出精子长非编码RNA LA16c390E6. 5作为预测导致不明原因胚胎 停滞发育的男性不育患者的检测指标，并通过临床样本予以进一步的证实，为临床诊断和 治疗原因不明的胚胎发育停止提供明确的依据。
[0015] 3、对于精子中长非编码RNA LA16c390E6. 5指标检测异常的男性病人，可以通过治 疗与干预后，通过检测该指标的变化指导是否适合做辅助生殖技术的周期。
【附图说明】
[0016] 图1为胚胎发育质量高和低的精子样本分别经试剂盒检测得到的长非编码RNA分 子LA16c390E6. 5相对表达量的分布图。
[0017] 其中，ctl为高胚胎质量组，p为低胚胎质量组。
[0018] 图2为精子长非编码RNA LA16c390E6. 5的表达变化与胚胎质量的生存曲线的分 析结果图。
【具体实施方式】
[0019] 下面结合【具体实施方式】对本发明的实质性内容作进一步详细的描述。
[0020] 实施例1 一种用于胚胎发育质量评估的试剂盒，用于测定精子长非编码RNA分子LA16c390E6. 5 的不同表达水平的生物标志物检测试剂，通过LA16c390E6. 5的表达水平评估胚胎发育质 量；所述LA16c390E6. 5的基因序列为：SEQID N0:1。
[0021] 实施例2 一种用于胚胎发育质量评估的试剂盒，用于测定精子长非编码RNA分子LA16c390E6. 5 的不同表达水平的生物标志物检测试剂，通过LA16c390E6. 5的表达水平评估胚胎发育质 量；所述LA16c390E6. 5的基因序列为：SEQID N0:1。
[0022] 试剂盒包括阳性对照品、反转录体系、荧光定量PCR反应体系、SYBR Green试剂和 LA16c390E6. 5特异性引物探针。
[0023] 实施例3 一种用于胚胎发育质量评估的试剂盒，用于测定精子长非编码RNA分子LA16c390E6. 5 的不同表达水平的生物标志物检测试剂，通过LA16c390E6. 5的表达水平评估胚胎发育质 量；所述LA16c390E6. 5的基因序列为：SEQID N0:1。
[0024] 试剂盒包括阳性对照品、反转录体系、荧光定量PCR反应体系、SYBR Green试剂和 LA16c390E6. 5特异性引物探针。
[0025] 所述的阳性对照品为正常精子样本的RNA提取的cDNA。
[0026] 实施例4 一种用于胚胎发育质量评估的试剂盒，用于测定精子长非编码RNA分子LA16c390E6. 5 的不同表达水平的生物标志物检测试剂，通过LA16c390E6. 5的表达水平评估胚胎发育质 量；所述LA16c390E6. 5的基因序列为：SEQID N0:1。
[0027] 试剂盒包括阳性对照品、反转录体系、荧光定量PCR反应体系、SYBR Green试剂和 LA16c390E6. 5特异性引物探针。
[0028] 所述的阳性对照品为正常精子样本的RNA提取的cDNA。
[0029] 所述LA16c390E6. 5的特异性引物探针， 上游引物为：CTCAACATCACAGCACAGGG ; 下游引物为：AGCTGCTTGGCCTCAmTC。
[0030] 实施例5 本发明所述的胚胎发育质量评估试剂盒的使用方法，步骤如下： A、 RNA提取：采用RNA抽提试剂提取精液样本中的RNA ; B、 荧光定量PCR :对提取到的RNA进行反转录成cDNA，取cDNA为模板，采用SYBR Green 染料法进行实时荧光定量PCR分析，检测受试样本与对照品的Ct值； C、 结果分析：将检测值采用2-AACt方法换算成相对表达量。
[0031] 具体实验操作如下： 1、RNA提取：把3ml精液样本收集到15ml离心管中，加入5mlPBS，1000g，5min洗涤两 次，弃上清，收集沉淀，加入 lml Trizol Reagent (life technologies，REF15596026)提取 RNA〇
[0032] 2、反转录：反转录体系采用的引物来自于PrimeScript RT Reagent kit(TAKARA， RR037A)〇
[0033]按表1顺序配制反转录反应体系 表1
【主权项】
1. 一种用于胚胎发育质量评估的试剂盒，其特征在于：用于测定精子长非编码RNA分 子LA16c390E6. 5的不同表达水平的生物标志物检测试剂，通过LA16c390E6. 5的表达水平 评估胚胎发育质量；所述LA16c390E6. 5的基因序列为：SEQIDNO: 1。
2. 根据权利要求1所述的一种用于胚胎发育质量评估的试剂盒，其特征在于：所 述的试剂盒包括阳性对照品、反转录体系、荧光定量PCR反应体系、SYBRGreen试剂和 LA16c390E6. 5特异性引物探针。
3. 根据权利要求1所述的一种用于胚胎发育质量评估的试剂盒，其特征在于：所述的 阳性对照品为正常精子样本的阳性RNA提取的cDNA。
4. 根据权利要求1所述的一种用于胚胎发育质量评估的试剂盒，其特征在于：所述 LA16c390E6. 5的特异性引物探针， 上游引物为：CTCAACATCACAGCACAGGG; 下游引物为：AGCTGCTTGGCCTCAmTC。
5. 根据权利要求1所述的胚胎发育质量评估试剂盒的使用方法，其特征在于：步骤如 下： A、RNA提取：采用RNA抽提试剂提取精液样本中的RNA; B、 荧光定量PCR:对提取到的RNA进行反转录成cDNA，取cDNA为模板，采用SYBRGreen 染料法进行实时荧光定量PCR分析，检测受试样本与对照品的Ct值； C、 结果分析：将检测值采用2-AACt方法换算成相对表达量。
【专利摘要】本发明提供了一种用于胚胎发育质量评估的试剂盒和使用方法。该试剂盒为用于测定精子长非编码RNA分子LA16c390E6.5的不同表达水平的生物标志物检测试剂，通过LA16c390E6.5的表达水平评估胚胎发育质量；所述LA16c390E6.5的基因序列为：SEQID NO:1。临床通过精子的分子标记物长非编码RNA分子LA16c390E6.5能准确的预测胚胎发育的潜能，并对疗效检测与辅助生殖方式的选择有指导意义。
【IPC分类】C12Q1-68
【公开号】CN104789684
【申请号】CN201510220546
【发明人】许文明, 王可, 杨明, 陈艳, 廖惠娟, 孙华钦
【申请人】四川大学华西第二医院
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2015年5月4日