基于荧光定量pcr熔解曲线法的dhav分型检测法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种基于荧光定量PCR熔解曲线法的DHAV(甲型鸭肝炎病毒）分型检 测法。
【背景技术】
[0002] 甲型鸭肝炎病毒（Duck hepatitis A virus，DHAV)是一种引起雏鸭病毒性肝 炎的主要病原。其主要以1~21日龄的雏鸭发生急性坏死性肝炎为病理特征，发病迅速 且死亡率高并具有高度的传染性，目前已呈世界性分布。DHAV根据遗传进化距离可分为 DHAV-A，DHAV-B，DHAV-C共三种基因型，其中我国的优势毒株主要是DHAV-A和DHAV-C。由 于针对的DHAV特异性抗体很难通过产蛋鸭传递给雏鸭，故当前主要依靠对雏鸭注射弱毒 疫苗或特异性的卵黄抗体来防治该病的发生。然而大量实验证实，不同基因型的DHAV之间 缺乏交叉保护能力，即使用针对DHAV-A的弱毒疫苗或卵黄抗体对防治DHAV-C的感染不起 作用，反之亦然。由于两种基因型的病毒感染雏鸭后所表现出的临床症状和病理变化非常 相似，仅凭眼观病理变化无法辨别；且当前DHAV-A和DHAV-C的共流行现象日趋严重，给该 病的正确诊断和防治带来了极大的困难。故迫切需要建立一种可行的方法，能快速检测患 病雏鸭所感染的DHAV属于何种基因型，以此来指导临床正确使用同型的卵黄抗体和弱毒 疫苗。
[0003] 目前，使用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR)检测DHAV的基因片段是其主要的快 速检测方法，但该方法不能对病毒进行定量。也有报道同时使用两对引物用以检测和区分 DHAV-A和DHAV-C，但该方法的灵敏度以及操作的简便性都有所欠缺，并需要进行核酸电泳 才能完成从而增加了检测的耗时。荧光定量RT-PCR技术因具有特异性、准确性、全封闭反 应等优点，已经成为快速检测病原微生物的重要手段。将RRT-PCR应用于DHAV的检测已 有报道。Miao等建立了 Taq man探针法的RRT-PCR技术分别检测鸭胚和鸡胚尿囊液中的 DHAV-A。根据DHAV-A的3D基因保守区序列设计水解探针和引物，可检测到大约10个拷贝 的DHAV-A的基因组RNA。Huang等建立了 SYBR Green法的RRT-PCR技术用以检测临床组织 中的DHAV-C。根据DHAV-C的2C基因保守区序列设计一对引物，可检测到大约3000个拷贝 的DHAV-C的基因组RNA。但目前尚未有关使用一种RRT-PCR来鉴别诊断不同基因型DHAV 的报道。由于SYBR Green荧光染料因能与所有的DNA双链相结合，对模板没有选择性，且 其价格便宜故更适用于多种目的产物的检测。溶解曲线分析法是把SYBR Green法扩增后 的PCR产物从一定的温度开始缓慢上升至95°C，扩增产物双链DNA随温度升高逐渐变性解 链产生单链。解链过程中嵌到双链中的荧光染料SYBR Green会被释放出来，仪器自动检测 反应管内荧光信号的变化，最后绘制出扩增产物荧光信号随温度变化的溶解曲线，并得到 相应PCR产物的溶解曲线峰图。因此不同大小，不同基因组成的PCR产物，其溶解曲线峰型 图不一样。
[0004] 本发明通过比较大量不同基因型的DHAV，在其G+C含量差异明显的5' UTR区域， 设计出一对引物能够同时扩增DHAV-A和DHAV-C ;并通过比较扩增产物的溶解曲线来简便、 快速地鉴别检测样品中的病毒基因型。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种基于荧光定量PCR熔解曲线法 的DHAV(甲型鸭肝炎病毒）分型检测法。本发明检测方法在一个PCR反应体系中仅加一 对引物，单管检测A、C基因型，方法简单易行，耗时少；整个扩增和检测过程均为闭管操作， 避免了 PCR扩增产物的污染，减少了假阳性结果；本检测法扩增片段短，采用较高的退火温 度，保证了扩增的特异性。荧光定量PCR仪扩增后经熔解曲线步骤后即可通过Tm值简便、 快速地鉴别DHAV基因型。本发明建立了一种快速检测分型鸭甲肝病毒的方法，给该病的正 确诊断和防治提供了极大的便利，为农业生产带来经济效益。
[0006] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0007] 第一方面，本发明提供一种基于荧光定量PCR熔解曲线法的甲型鸭肝炎病毒分型 检测用引物，所述引物如下：
[0008]DHAV-F:5'GTTGTGAAACGGATTACCGGTAGT 3'，
[0009]DHAV-R:5,ACTCGACCAGCCGCGACCCTAT 3,。
[0010] 第二方面，本发明提供一种基于荧光定量PCR熔解曲线法的甲型鸭肝炎病毒分型 检测用阳性质粒，所述质粒包括PMD-19T-DHAV-A和pMD-19T-DHAV-C。
[0011] 第三方面，本发明提供一种基于荧光定量PCR熔解曲线法的甲型鸭肝炎病毒分型 检测用阳性质粒标准品；
[0012] 所述阳性质粒标准品中所述质粒的浓度为lX10ncopies/yL ;使用过程中可以 稀释为浓度梯度。
[0013] 第四方面，本发明提供一种基于荧光定量PCR熔解曲线法的甲型鸭肝炎病毒分型 检测方法，所述检测方法包括：
[0014] 步骤一、病毒RNA的提取和CDNA合成：从攻毒鸭组织中提取甲型鸭肝炎病毒总 RNA，反转录得cDNA ;
[0015] 步骤二、阳性标准模板的制备：以所述cDNA为模板，以所述DHAV-F和DHAV-R为引 物，对甲型鸭肝炎病毒的目的基因进行PCR扩增；用所述PCR扩增产物构建所述阳性重组质 粒；
[0016] 步骤三、基于荧光定量PCR熔解曲线法的甲型鸭肝炎病毒分型检测方法的建立： 以所述阳性重组质粒为模板，优化所述PCR反应条件，绘制标准曲线、熔解曲线；
[0017] 步骤四、方法验证：将步骤三建立的实时荧光定量PCR检测方法进行如下验证：
[0018] 特异性试验：采用步骤三所述荧光定量PCR检测方法、依据所述标准曲线和熔解 曲线，对甲型鸭肝炎病毒及非甲型鸭肝炎禽源病毒进行特异性检测；
[0019] 敏感性试验：稀释所述阳性质粒标准品，同时设立普通PCR对照组，分别进行扩 增，得最低模板检出拷贝数；
[0020] 重复性试验：分别对所述阳性质粒标准品做批内和批间重复，同时设阴性对照，通 过对甲型鸭肝炎病毒的TM值和熔解曲线的分析相关变异系数的计算，验证所述甲型鸭肝 炎病毒分型检测方法的重复性。
[0021] 优选地，步骤一中，所述鸭包括北京鸭，所述组织包括肝脏。
[0022] 优选地，步骤三中，所述PCR反应条件包括引物浓度、退火温度。
[0023] 优选地，所述引物浓度范围为0. 04~1. 04umol/L ;所述退火温度为54~62°C。
[0024] 优选地，所述引物浓度为0. 24umol/L ;所述退火温度为55°C。
[0025] 优选地，步骤四的特异性试验中，所述甲型鸭肝炎病毒包括DHAV-A、DHAV-C ;所述 非甲型鸭肝炎禽源病毒包括鸭呼肠孤病毒、新城疫病毒、禽流感病毒、鸡传染性支气管炎病 毒、鹅细小病毒、鸭瘟、鸭产蛋下降综合症病毒、鸭坦布苏病毒等。
[0026] 优选地，步骤四的敏感性试验中，所述稀释包括按照10倍梯度稀释；本操作实施 得出荧光定量PCR检测方法检测出的最低模板检出拷贝数为100拷贝/ y L。
[0027] 优选地，所述步骤四的重复性试验中，所述批内和批间重复具体指做3个批内重 复和3个批间重复，阳性重组质粒浓度分别采用：lX10 7copies/yL、lX105copies/yL、 1 X 104copies/ y L〇
[0028] 优选地，所述阳性质粒浓度为 1 X 107copies/ y L、1 X 105copies/ y L。
[0029] 综上所述，本发明通过采用一对引物成功建立了基于荧光定量PCR熔解曲线法的 甲型鸭肝炎病毒分型检测法，经荧光定量PCR仪扩增后经熔解曲线步骤后即可通过Tm值简 便、快速地鉴别DHAV基因型。
[0030] 与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
[0031] 1、该检测法中一个PCR反应体系中仅加有一对引物，单管检测A、C基因型，方法简 单易行，耗时较少；
[0032] 2、该检测法无需使用Taq Man探针，降低了检测成本，减少假阴性结果的出现；
[0033] 3、整个扩增和检测过程均为闭管操作，不需开盖吸取扩增产物进行电泳，避免了 PCR扩增产物的污染，减少了假阳性结果；
[0034] 4、该检测法扩增片段短，采用较高的退火温度，也可保证扩增的特异性；
[0035] 5、SYBR Green是一种不对称腈类荧光素，能非特异性地嵌合于DNA双螺旋结构中 的小沟内，荧光强度的大小代表DNA双链分子的多少，因此从荧光强度的强弱即可初步判 断DNA双链分子的多少；
[0036] 6、当两条DNA分子复性结合时荧光最强，随温度上升荧光强度降低并出现一较恒 定的坡度，当温度达到Tm值时荧光强度急剧下降；经过软件分析可得到熔解曲线图，其波 峰所在的温度代表双链DNA分子的Tm值；即可通过Tm值简便、快速地鉴别DHAV基因型；
[0037] 7、Tm值的大小取决于扩增DNA片段的长度及其序列中G/C含量，因此扩增产物不 同对应的Tm值也不同，经熔解曲线法分析后即可通过Tm值鉴别DHAV基因型，减少及排除 非特异扩增产物及引物二聚体的干扰，保证了该