一种针对cd47的单域抗体的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种针对CD47的单域抗体，具体设计一种针对CD47分子胞外段的驼 源单域抗体，属于纳米抗体技术领域。
【背景技术】
[0002] ⑶47是一种广泛表达于多个物种和各个组织之间的膜糖蛋白，其与抑制性受体 信号调节蛋白a互为受体和配体，并可以形成CD47-SIRPa信号复合体，该信号复合物具有 介导双向信号调节并调控多种免疫反应进程的作用。在正常造血干细胞（hematopoietic stem cells，HSCs)上，⑶47表达的意义在于保持其在机体内的相对稳定。在白血病、非霍奇 金淋巴瘤、膀胱癌和乳腺癌等恶性疾病的研宄中，发现肿瘤细胞存在CD47的升高，且CD47 的高表达提示临床预后不良；一些类型的肿瘤干细胞（cancer stem cells,⑶Cs)中存在 ⑶47的过表达。肿瘤细胞通过借此"别吃我"信号，逃避了肿瘤免疫。通过使用抗⑶47抗 体阻断CD47和SIRPa的相互作用具有靶向性治疗的效果，对正常细胞的影响非常小。在白 血病的治疗中，可在现有的经典化疗的基础上联合CD47抗体针对白血病肿瘤干细胞进行 靶向杀伤，可在最大限度上增加抗肿瘤疗效，为白血病的治疗提供新的探索方向，对治疗的 个体化和进一步提高疗效具有什么重要的意义。
[0003] 纳米抗体技术，是生物医学科学家在传统抗体的基础上，运用分子生物学技术结 合纳米粒子科学的概念进行的抗体工程革命，从而研发出的最新和最小的抗体分子，最初 由比利时科学家Hamers，R从骆驼血液中的单独重链抗体中分离得到，因此也叫做驼源单 域抗体。该种抗体的单域性质使其较普通抗体具有一些独特的性质。（1)分子量小，结构 稳定，溶解性高，可有序固定。纳米抗体是已知分子量最小的抗体，为普通抗体的十分之一 (15KD)。由于纳米抗体的FR2 (frame-work 2)中的疏水残基被亲水残基取代，使纳米抗体 水溶性增加，聚合性减少。研宄发现，在37°C孵育1周后纳米抗体仍保持80%的结合活性， 说明其在室温下更易于使用和长时间保存。在高于90°C的环境中长期放置后仍能重新获得 抗原结合能力。同时，纳米抗体在强变性剂和极度PH值环境下也表现出高度的稳定性，而 普通的抗体则发生不可逆的聚合。由于纳米抗体拥有很小的体积且结构规整，所以固定起 来更加容易，可实现有序固定。（2)亲和力高，特异性强。相对于普通抗体的凹形或平面的 抗原结合面，其拥有较长的⑶R3 (complementarity-determining region 3)，可形成稳定、 暴露的凸形结构的结合面。这个凸形结构可以深入抗原内部，更有效的与抗原表位形成的 凹形拓扑结构结合，不仅提高了纳米抗体的抗原特异性和亲和力，同时识别许多普通抗体 无法识别的抗原。甚至，当蛋白紧密包裹隐藏了普通抗体识别位点时，纳米抗体也可对其进 行表位识别。（3)免疫原性弱，穿透性强。纳米抗体对人体的免疫原性弱，与人的生物相容 性好。免疫原性与分子的大小、化学结构有关，相对分子量越小免疫原性越小。研宄证明，动 物实验中纳米抗体未引起任何体液和细胞免疫应答。同时，纳米抗体的组织穿透能力强，可 进入致密的组织，多余未结合的纳米抗体能够被快速清除，有利于疾病的诊断及治疗。（4) 成本低廉，可规模化生产。纳米抗体相对于分子质量小，且结构简单，能被单个基因编码，利 用基因工程可在酵母菌、E. coli等微生物中大量表达。
[0004] 纳米抗体因其特殊的结构性质，兼具了传统抗体和小分子药物的优势，几乎完美 地克服了传统抗体的开发周期长，稳定性低，保存条件苛刻等缺陷。这种分子量仅为常规抗 体1/10的驼源单域抗体逐渐成为新一代抗体诊断及治疗中的新兴力量。因此应用纳米抗 体技术研发CD47治疗性抗体药物具有广阔的前景。
【发明内容】
[0005] 针对上述现有技术，本发明提供了一种针对CD47胞外段的单域抗体，同时提供了 该单域抗体的编码序列，含有该编码序列的载体、宿主细胞。
[0006] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0007] -种针对CD47的单域抗体，为针对CD47胞外段的单域抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO :9所示，由4个框架区和3个互补决定区组成，其中，4个框架区的氨基酸序列分别如 SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4 所示，3 个互补决定区的氨基酸序 列分别如SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7所示。互补决定区主要负责抗原的识 另IJ，框架区结构相对稳定，主要起着支撑维持蛋白质结构的作用。
[0008] -种编码上述单域抗体的核酸，其核苷酸序列为以下序列之一：
[0009] (1)如SEQ ID NO. 8所示的核苷酸序列；
[0010] (2) SEQ ID NO. 8所示的核苷酸序列添加、取代、缺失或插入一个或若干个核苷酸 的序列；
[0011] (3)在严格条件下，与（1)或（2)的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；
[0012] (4)由于遗传密码子的简并性区别于（1)、（2)、（3)的核苷酸序列的核苷酸序列。
[0013] SEQ ID N0：1 FRl ：QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAAS〇
[0014] SEQ ID NO :2 FR2 :WVRQAPGKGLEWVSG。
[0015] SEQ ID NO ：3 FR3 ：YYEDSVKGRFTISRSNAKNTLYLQLNSLKTDDTAMYYC〇
[0016] SEQ ID NO :4 FR4 :WGQGTQVTVSS。
[0017] SEQ ID NO :5 CDRl :GFTFSSYDMS。
[0018] SEQ ID NO :6 CDR2 :MNSGGGRT。
[0019] SEQ ID NO :7 CDR3 :VTSDFAY。
[0020] SEQ ID NO :8 :cag gtg cag ctg cag gag tct gga gga ggc ttg gtg cag cct ggg ggg tct ctg aga etc tee tgt gca gee tct gga ttc aca ttc agt age tac gac atg age tgg gtc cgc cag get ccg ggg aag ggg etc gag tgg gtc tea ggt atg aat agt ggt ggt ggt aga aca tac tat gaa gac tee gtg aag ggc cga ttc acc ate tee agg tee aac gee aag aac acg ctg tat ctg caa ctg aac age ctg aaa act gac gac acg gee atg tat tac tgt gtc aca tee gac ttt get tac tgg ggc cag ggg acc cag gtc acc gtc tee tca〇
[0021] SEQ ID NO :9 :
[0022] QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPGKGLEWVSGMNSGGGRTYYEDSVKGRFT ISRSNAKNTLYLQLNSLKTDDTAMYYCVTSDFAYWGQGTQVTVSS。
[0023] 本发明的核苷酸序列或至少部分序列可以通过合适的表达系统进行表达以得到 相应的蛋白质或多肽。这些表达系统包括细菌，酵母菌，丝状真菌，动物细胞，昆虫细胞，植 物细胞，或无细胞表达系统。
[0024] -种表达载体，其包含有上述编码针对⑶47的单域抗体的核酸。
[0025] -种宿主细胞，包含上述表达载体。
[0026] 所述宿主细胞的受体菌优选大肠杆菌。
[0027] 所述针对CD47的单域抗体在检测CD47中的应用，具体应用时，利用本发明的 针对⑶47的单域抗体与⑶47特异性结合的能力，采用酶联免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，焚光免疫法（Fluoroimmunoassay，FIA)，免疫芯片法和亲和 层析法等进行检测。
[0028] 所述针对CD47的单域抗体在制备检测CD47的试剂或试剂盒中的应用；所述检测 CD47的试剂或试剂盒中含有针对CD47的单域抗体。
[0029] 所述针对CD47的单域抗体在制备CD47治疗性抗体药物中的应用。
[0030] 本发明首先合成CD47多肽（胞外段），并使其具有免疫原性，然后将CD47多肽分 子偶联在酶标板上，展示该蛋白的正确空间结构，以此形式的抗原利用噬菌体展示技术筛 选免疫纳米抗体基因库（骆驼重链抗体噬菌体展示基因库），从而获得了 CD47特异性的纳 米抗体基因，将此基因转至大肠杆菌中，从而建立了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体 株。本发明的针对CD47的单域抗体在研发CD47治疗性抗体药物方面具有广