水稻叶夹角的表观调控位点及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及一种水稻叶夹角的表观调控位点，所 述表观调控位点通过改变旁邻基因的表达来控制水稻的叶夹角。
【背景技术】
[0002] 水稻作为重要的粮食作物，同时也是单子叶的模式植物。水稻理想株型是高产育 种的形态结构和物质基础。叶夹角是水稻株型的重要组成部分，指的是叶片与茎杆间的夹 角。叶夹角特别是剑叶叶夹角的大小在很大程度上调节水稻的光合生产量，进而影响水稻 产量。水稻叶片角是高产育种理想株型的重要因素之一，受到油菜素内酯（BR)的调节和控 制。内源BR浓度直接控制着水稻叶夹角大小，BR缺失或敏感性降低都会导致水稻叶片直 立，说明BR能够有效地调控水稻的株型。已有研究表明，降低BR信号可使水稻叶片直立， 有利于水稻的合理密植最终提高产量（Sakamoto等，2006)。目前，利用正向和反向遗传学 方法鉴定了许多水稻BR代谢途径的成员，使人们对水稻BR代谢过程有了更深入地认识。 2002年Mori等在水稻中鉴定了 BR合成途径相关的突变体brdl (brassinosteriod-depen dentl)。brdl突变体表现为典型的BR缺乏症状：茎杆严重矮化，叶片弯曲僵硬呈畸形，穗形 和谷粒等偏小，并且在外源施加 BL后能够恢复突变体表型。这是水稻中首次确定的BR合 成相关的突变体。该基因与番茄和拟南芥的BR6ox同源命名为0sBR6 〇X，该酶属于细胞色 素 P450家族。随后，Hong等鉴定了 BR缺乏性矮杆突变体brd2,该突变体也表现出明显的 BR缺乏性症状：叶片直立，植株矮化等。brd2基因是拟南芥DM1/DWF1基因的同源序列，主 要催化BR生物合成早期24-亚甲基固醇（24-methylenecholesterol，24_MC)到油菜留醇 (campesterol，CR)的转化。OsLIC编码一个保守的CCCH型锌指蛋白，作为BR信号的负调 因子调节其合成影响叶夹角的分子机理（Wang等，2008a)。在水稻中编码HLH蛋白的BUl 基因作为BR的响应因子，将其过表达后可以使植株叶夹角变大（Tanaka等，2009)。以上BR 合成突变体分析说明，BR在水稻的叶夹角调控中具有重要作用。
[0003] 另外研究发现，GAST基因家族成员OsGSRl可以与与BR生物合成中催化24-亚甲 基固醇（24-methylenecholesterol)到油菜留醇（campesterol)转化的酶DIM/DWF1 互作。 说明OsGSRl是通过直接作用于BR合成酶DM/DWF1来调控BR生物合成，进而调节水稻叶 夹角（Wang等，2009)。OsGSRlRNAi植株出现类似于植株缺乏BR引起的表型，包括初生根变 短、叶片直立以及育性降低。OsGSRlRNAi植株内源BR含量降低，同时其矮化表型可以被外 施BL所恢复。鉴于BR对水稻叶夹角的调节作用，改变BR的合成或信号敏感性相关基因可 以作为改良水稻株型的有效手段。同时，对于BR分子机制深入解析，使得这些基因有望成 为新的育种分子元件，通过遗传操作BR途径改良水的稻株型以增加水稻产量。
[0004] MITEs (mininature inverted-repeats transposable elements)是植物中重要 的一类转座子在许多真核生物和原核生物基因组中都存在（Feng et al.，2002;Feschotte et al.，2002)。MITEs片段较小（通常80-500bp)，而且在基因组中有很多的拷贝，大多数 都存在于靠近基因附近的非编码区（内含子，5' -UTRs，3' -UTRs)，可能调控附近基因的 表达（Oki et al.，2008 ;Piriyapongsaand Jordan，2008)。与拟南芥不同，在水稻中 MITEs 是拷贝数最高的转座子（Jiang et al.，2004)。MITEs转录后形成具有茎环结构的RNA， 可以产生siRNA和miRNA两类小分子RNA，它是siRNA向miRNA进化转变过程的中间体 (Piriyapongsa and Jordan，2008)。水稻中由 MITE 产生的 siRNA441、siRNA446 在水稻响应 ABA信号途径以及干旱、盐、冷等非生物胁迫时可能作为正调控因子。它们主要通过降解靶 基因 F-box基因 mRNA来发挥作用（Yan et al.，2011)。遗传学分析表明，植物24-nt siRNA 效应通路中关键蛋白包括DCL3、RDR2和AG04,它们通过参与siRNA的产生和RISC的形成， 来控制基因组特异序列的DNA和组蛋白甲基化修饰，从而对靶基因进行沉默。水稻中存在 两个DCL3基因，芯片数据显示0sDCL3a在水稻各部位表达量较高（Kapoor et al.，2008)。 从进化分析上看，0sDCL3a与AtDCL3a同源性更高，它负责24nt ImiRNA的产生并通过对其 靶基因位点进行DNA甲基化修饰调控靶基因的表达（Wu et al.，2010)。同时，0sDCL3a在 水稻中也负责加工产生重复序列区域的24-ntsiRNA(Song et al.，2012)。我们田间观察 发现，敲除水稻〇sDCL3a的转基因株系（3a_3和3a_l)都表现出叶夹角变大，矮化的异常发 育表型。与拟南芥相比，水稻基因组中含有更加丰富的转座子或重复序列，并且这些序列存 在多数水稻基因附近。来源于转座子或重复序列的24-nt siRNA可能通过对旁邻基因进行 DNA或组蛋白甲基化表观修饰来调控其表达，最终精细地调节水稻的整个发育阶段。
[0005] 水稻是我国最重要的粮食作物之一，关系到我国粮食安全以及人民生活的基本保 障。水稻株型育种一直是现代育种学家关注的焦点问题之一。随着分子生物学、功能基因组 学以及高通量测序等手段的广泛应用，表观调控水稻叶夹角相关基因，进而影响水稻株型 的分子机理研究不断深入，可以为分子改良作物的重要农艺性状提供了重要线索和依据。
[0006] 本研究首次提供了水稻叶夹角的表观调控位点，这不仅提供了一种水稻株型育种 的方法，而且为解决现代分子设计育种问题提供了一个切实的方案，具有重要的意义。
【发明内容】
[0007] 本发明包含了 2个BR合成代谢和1个水稻叶夹角相关基因，旁邻MITEs产生 24-ntsiRNA能够表观调控这些基因的表达，为水稻株型育种提供重要线索和依据，可作为 筛选水稻理想株型资源的新手段。
[0008] 本发明所提供的水稻叶夹角表观调控位点，包括2个BR合成代谢和1个水稻叶夹 角相关基因的旁邻MITEs位点，所述旁邻MITEs位点的核苷酸序列分别如SEQ ID NO :1、SEQ IDNO :2 和 SEQ IDNO :3 所示。
[0009] 其中，SEQ ID NO :1为由47Sbp DNA序列组成的Ditto-like MITE类转座子，位 于0sGSRlL0C_0s06gl5620基因上游的-888bp到-411bp，此位点能够产生高丰度的24-nt siRNA，通过介导表观修饰调控旁侧BR合成代谢相关基因 OsGSRl的表达；序列表中的SEQ ID NO :2 为由 308bp DNA 序列组成的 Tourist-like MITE 类转座子，位于 0sBR6ox L0C_ 0s03g40540基因上游-457bp到-150bp，此位点能够产生高丰度的24-nt siRNA，通过介导 表观修饰调控旁侧BR合成代谢相关基因0sBR6ox的表达；序列表中的SEQ ID NO :3为由 250bp DNA序列组成的Ditto-like MITE类转座子（2个温带粳稻：日本晴，IRGC418)，位于 L0C_0s08gl9420基因上游-1177bp到-928bp，此位点能够产生高丰度的24-nt siRNA，通过 介导表观修饰调控旁侧水稻叶夹角相关基因 L0C_0s08gl9420的表达；序列表中的SEQ ID NO :4为由156bp DNA序列组成的Ditto-like ΜΙΤΕ类转座子（2个热带粳稻：IRGC17757， IRGC328)，位于L0C_0s08gl9420基因上游-1177bp到-928bp，此位点序列在温热带粳稻序 列间存在差异，可能通过调控旁侧基因 L0C_0s08gl9420的差异表达，进而造成温热带粳稻 叶夹角的不同。
[0010] 本发明还提供了一种检测水稻叶夹角的表观调控位点的方法，所述方法包括首先 检测水稻材料中是否含有完整的如SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2和/或SEQ ID NO :3所示 的转座子序列，然后分析此位点的表观修饰以及旁邻基因的表达是否改变。由本发明中所 述的水稻叶夹角的表观调控位点可知，能够通过CRISPR/Cas9技术在水稻基因组上定点编 辑表观修饰，进而调控水稻叶夹角相关基因的表达，最终实现理想株型的分子设计。
[0011] 本发明还提供了一种检测水稻叶夹角的分子标记，所述分子标记即检测不同水稻 资源中内源SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2和/或SEQ ID N0:3是否存在自然变异，进一步分 析这些自然变异是否产生表观修饰的改变，从而判断该水稻品种是否符合理想株型育种的 需求。由于这种检测可以在水稻幼苗期就进行检测，从而选出具有优良株型的水稻植株，