菘蓝4-香豆酰辅酶a连接酶蛋白家族编码序列及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及菘蓝4-香豆酰辅酶A连接酶蛋白家族的核苷酸序列及其应用，本发明 还涉及菘蓝4-香豆酰辅酶A连接酶蛋白家族的氨基酸序列，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 菘蓝为十字花科植物，其根入药，即为常用中药板蓝根，有清热解毒，凉血利咽等 功效，应用十分广泛，主要制剂有板蓝根颗粒、板蓝根含片等，临床用于流行性感冒、流行性 乙型脑炎、流行性腮腺炎、急慢性肝炎、带状疱疹等。化学成分及药理活性研究表明落叶松 脂素是菘蓝发挥抗病毒功效的重要活性物质基础。因此，提高落叶松脂素的含量是获得抗 病毒活性高的优良菘蓝品系的关键，具有重要的应用价值；同时，落叶松脂素属于木脂素类 成分，降低菘蓝中落叶松脂素的含量，减少木质化的程度，能有效降低以其作为原料转化为 生物燃料的难度，对于生物能源的生产也具有重要意义。
[0003] 植物次生代谢工程是利用基因工程和分子生物学方法阐明植物次生代谢产物生 物合成的机制，了解清楚代谢途径和相关酶的信息，对控制生物合成路径的基因进行调控， 从而达到在分子水平上改造代谢途径，调控目标产物的定向合成，趋利避害，提高或降低植 物中特定化合物产量的目的。经文献检索发现，4-香豆酰辅酶A连接酶（4CL)对落叶松脂 素的生物合成起到了非常重要的调控作用，是木脂素代谢工程的重要靶点。因此，从菘蓝中 分离获得4-香豆酰辅酶A连接酶并利用其进行目标性的代谢调控，一方面有可能打破落叶 松脂素生物合成限速瓶颈，获得落叶松脂素高产的高品质菘蓝株系；另一方面有可能降低 以落叶松脂素为代表的木脂素的含量，减少菘蓝木质化的程度，为生物能源的生产提供有 效的原材料。目前尚未发现与本发明所提及的菘蓝4-香豆酰辅酶A连接酶蛋白及应用的 相关报道。
【发明内容】
[0004] 本发明提供了编码菘蓝4-香豆酰辅酶A连接酶蛋白家族的核苷酸序列，其特征在 于：其核苷酸序列分别如SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3所示。
[0005] 本发明还提供了菘蓝4-香豆酰辅酶A连接酶蛋白家族的氨基酸序列，其特征在 于：其序列如 SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5 以及 SEQ ID NO. 6 所示。
[0006] 本发明还提供了一种通过调控菘蓝4-香豆酰辅酶A家族蛋白的表达以改变落叶 松脂素的生物合成的应用。
[0007] 发明作用与效果
[0008] 本发明提供了菘蓝4-香豆酰辅酶A连接酶蛋白家族的三段编码序列，分别如SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3 所示。
[0009] 本发明还提供了菘蓝4-香豆酰辅酶A连接酶蛋白家族的氨基酸序列，其特征在 于：其序列如 SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5 以及 SEQ ID NO. 6 所示。
[0010] 本发明还提供了一种通过调控菘蓝4-香豆酰辅酶A家族蛋白的表达以改变落叶 松脂素的生物合成的应用。
【附图说明】
[0011] 图1是Ii4CL蛋白的氨基酸序列与拟南芥中4CL蛋白氨基酸序列的比对；
[0012] 图2是Ii4CLl、Ii4CL2、Ii4CL3融合蛋白在大肠杆菌E. coli BL21(DE3)中原核表 达的SDS-PAGE检测；
[0013] 图3是Ii4CLl、Ii4CL2、Ii4CL3经纯化的融合蛋白的SDS-PAGE检测；
[0014] 图4是抑制Ii4CLl的株系与野生型株系的Ii4CLl的相对表达量；
[0015] 图5是抑制Ii4CLl的株系与野生型株系的落叶松脂素的含量对比；
[0016] 图6是抑制Ii4CL2的株系与野生型株系的Ii4CL2的相对表达量；
[0017] 图7是抑制Ii4CL2的株系与野生型株系的落叶松脂素的含量对比；
[0018] 图8是抑制Ii4CL3的株系与野生型株系的Ii4CL3的相对表达量；以及 [0019] 图9是抑制Ii4CL3的株系与野生型株系的落叶松脂素的含量对比。
【具体实施方式】
[0020] 〈实施例一〉菘蓝4-香豆酰辅酶A连接酶家族基因的克隆
[0021] 1.组织分离
[0022] 菘蓝（I. indigotica)叶片采集自第二军医大学药学院植物园，采取材料后，立即 置于液氮中冷冻保存。
[0023] 2. mRNA 的分离
[0024] 取部分组织，用研钵研碎，加入盛有裂解液的50ml管，充分振荡后，再移入玻璃匀 浆器内。匀浆后移至50ml新管，使用TRIzol (TRIzol Reagents, Gibco, NY, USA)试剂抽提 总RNA。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量。
[0025] 3.基因克隆（Cloning of the gene)
[0026] 3. L第一链cDNA的合成
[0027] 3. 2.菘蓝4-香豆酰辅酶A连接酶家族基因（Ii4CLl、Ii4CL2、Ii4CL3)编码区的 PCR扩增
[0028] 根据 GenBank登录的 4CL基因家族的编码序列（Genbank accessionNo. GU937875, Genbank accession No. KC430622，Genbank accession No. KC430623)，设计扩增出完整编 码框的上下游引物分别为：
[0029] 4CL1-F:ATGGAGAAATCCGGCTACGG;(SEQ ID No. 7)
[0030] 4CL1-R:TCACATCTTGGATCTT ACTT;(SEQ ID No. 8)
[0031] 4CL2-F:ATGGTGCTCCAACAACAACA;(SEQ ID No. 9)
[0032] 4CL2-R:CTACTTAGGGTACTCG GTTT;(SEQ ID No. 10)
[0033] 4CL3-F:ATGCAGAAACAGAGCAGCAA;(SEQ ID No. 11)
[0034] 4CL3-R:TTAGTTCACCAACCCA GTTG(SEQ ID No. 12)
[0035] 并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点（这可视选用的载体而定)，以 便构建表达载体。以第一链cDNA为模板，经PCR扩增后进行测序。· ·Α序列测定由上海博 亚或晶泰生物技术服务有限公司采用3730自动测序仪完成。测序结果表明，所克隆的序列 与GenBank登录的菘蓝4CL基因编码序列一致(表1至3)。
[0036] 表1.菘蓝Ii4CLl基因的全长cDNA及氨基酸序列
[0037]
【主权项】
1. 编码菘蓝4-香豆酰辅酶A连接酶蛋白家族的核苷酸序列，其特征在于： 其中，所述核苷酸序列分别如SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3所示。
2. 菘蓝4-香豆酰辅酶A连接酶蛋白家族的氨基酸序列，其特征在于： 其序列如 SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5 以及 SEQ ID NO. 6 所示。
3. -种通过调控菘蓝4-香豆酰辅酶A家族蛋白的表达以改变落叶松脂素的生物合成 的应用。
【专利摘要】本发明提供了菘蓝4-香豆酰辅酶A连接酶蛋白家族的三段编码序列，分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示。本发明还提供了菘蓝4-香豆酰辅酶A连接酶蛋白家族的氨基酸序列,其特征在于：其序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5以及SEQ ID NO.6所示。本发明还提供了一种通过调控菘蓝4-香豆酰辅酶A家族蛋白的表达以改变落叶松脂素的生物合成的应用。本发明在育种和生物能源方面具有重要的应用价值。
【IPC分类】C12N9-00, C12N15-52, A01H5-00
【公开号】CN104805096
【申请号】CN201410030374
【发明人】肖莹, 周洵, 杨颖博, 陈万生, 张磊
【申请人】中国人民解放军第二军医大学
【公开日】2015年7月29日
【申请日】2014年1月23日