一种海藻糖合酶及其编码基因与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种海藻糖合酶及其编码基因与应用，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 海藻糖（Trehalose)是一种由两个吡喃环葡萄糖分子经a -1，1-糖苷键连接构成 的非还原性二糖，广泛存在于细菌、酵母、丝状真菌、植物、昆虫、无脊椎动物等生物体体内。 研宄表明，其性质稳定，对生物体具有非常重要的生物学意义。主要表现在它是生物体能源 和碳源的储备物，是蛋白质和生物膜分子在脱水、高温、氧自由基、低温等恶劣环境中的稳 定剂和保护剂，是信号传感复合物和生长调控因子，而且还是某些细菌细胞壁的组分之一， 因此在科学界海藻糖有"生命之糖"的美誉。海藻糖对生物体具有神奇的保护作用，是因为 海藻糖在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣环境条件下在细胞表面能形成独特的保 护膜，有效地保护蛋白质分子不变性失活，从而维持生命体的生命过程和生物特征。这一独 特的功能特性，使得海藻糖除了可以作为蛋白质药物、酶、疫苗和其他生物制品的优良活性 保护剂以外，还是保持细胞活性、保湿类化妆品的重要成分，更可作为防止食品劣化、保持 食品新鲜风味、提升食品品质的独特食品配料。因此海藻糖可广泛的应用到医药、化妆品业 以及食品行业，具有诱人的开发应用前景和巨大的经济效益。
[0003] 鉴于海藻糖广泛而重要的应用价值，寻找海藻糖高效方便、低成本生产方法的研 宄被广泛重视。目前海藻糖的生产方法主要有酵母提取法、发酵法、酶合成法。其中酶法生 产海藻糖具有较高的特异性和快速温和等特点，已经成为研发海藻糖工业化生产的热点并 作为短期可见效的可行性途径之一。
[0004] 海藻糖合酶（EC5. 4. 99. 16, Trehalose synthase, TreS)是一种分子内葡糖苷转移 酶它只需要一步反应就可以将麦芽糖的α-1，4糖苷键转化为α-1，1糖苷键生成海藻糖。 该酶反应流程短，易调控，不需要消耗高能物质，不需要磷酸盐共存，只需要一种酶一步反 应就能获得海藻糖，因此海藻糖合酶转化法是适宜工业化生产海藻糖的方法，有着良好的 应用前景，受到广泛的关注。到目前为止，国内外有报道的能够产海藻糖合酶的微生物已经 超过15种。不同微生物来源的海藻糖合酶的催化效率、酶学性质各有不同，但具有基本共 同点：一是底物转化率较低，最高只有80%左右，一般为60% -70% ;二是酶的热稳定性较 差，最适反应温度为25°C左右；三是反应时间太长，一般为48小时，有的长达72h。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术的不足，本发明提供了一种热稳定性好，反应时间大大缩短的来源 于施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri Qlu3)的海藻糖合酶及其表达基因与应用。
[0006] 本发明技术方案如下：
[0007] 一种海藻糖合酶的表达基因，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0008] 一种海藻糖合酶，氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0009] 本发明所述海藻糖合酶是通过大肠杆菌原核高效表达后，利用亲和层析，离子交 换层析，分子筛层析等一系列纯化手段，最终获得。该海藻糖合酶与文献报道的施氏假单胞 菌（Pseudomonas stutzeri CJ38)海藻糖合酶氨基酸序列同源性为98%，但是其反应时间 大大缩短而且热稳定性良好。上述重组蛋白反应Ih即可达到反应平衡点，海藻糖转化率为 70%。上述重组蛋白在50°C金属浴中放置30min海藻糖转化率依然可以达到50%。上述 重组蛋白最适反应温度为35 °C。上述重组蛋白最适反应pH为8. 0。
[0010] 一种插入上述SEQ ID No. 1所示核苷酸序列的重组载体。
[0011] 一种转基因细胞系，含有上述重组载体。
[0012] 上述海藻糖合酶的表达基因、重组载体或转基因细胞系在制备海藻糖合酶中的应 用。
[0013] 上述海藻糖合酶在制备海藻糖中的应用。
[0014] 本发明所述的海藻糖合酶，由施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri Qlu3)中获 得，具体方法为：利用简并引物从施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri Qlu3)基因组中 扩增获得海藻糖合酶的全长基因。将该基因连接到pET-15b载体上构建成质粒，并转化到 大肠杆菌BL21DE (3)中进行原核表达。然后通过镍柱亲和层析，Source-Q离子交换层析， Superdex-200分子筛层析的方法分离获得高纯度的海藻糖合酶。
[0015] 有益效果
[0016] 本发明首次由施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri Qlu3)中获得海藻糖合酶， 该海藻糖合酶制备方法简便，产量大，纯度高；实验证实其热稳定性好，反应Ih海藻糖转化 率即可达到70%，较现有的海藻糖合酶反应时间大大缩短，可以降低海藻糖的生产成本，为 海藻糖的工业化生产奠定了基础。
【附图说明】
[0017] 图1是PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳结果照片；
[0018] 图中：M、Marker，T为海藻糖合酶的目的条带。
[0019] 图2为分子筛纯化后海藻糖合酶SDS-PAGE电泳图结果照片；
[0020] 图中：M 为 Marker ;B11，B12, Cl，C2, C3, C4, C5, C6, C7 为分子筛纯化后不同收集 管收集到的样品；
[0021] 图3为通过高效液相测定的葡萄糖、麦芽糖和海藻糖的标样峰状结果图；
[0022] 图4为通过高效液相测定反应结束后葡萄糖、海藻糖和麦芽糖的峰状结果图；
[0023] 图5为纯化后海藻糖合酶反应时间对转化率影响的曲线图；
[0024] 图6为文章报道的海藻糖合酶反应时间对转化率影响的曲线图；
[0025] 图7为纯化后海藻糖合酶酶活最适反应温度曲线及酶活温度稳定曲线图；
[0026] 其中，图7A为纯化后海藻糖合酶酶活的最适反应温度曲线；
[0027] 图7B为纯化后海藻糖合酶酶活温度稳定曲线；
[0028] 图8为纯化后海藻糖合酶最适反应pH曲线及pH稳定曲线图；
[0029] 其中，图8A为纯化后海藻糖合酶酶活最适反应pH曲线；
[0030] 图8B为纯化后海藻糖合酶酶活pH稳定曲线。
【具体实施方式】
[0031] 下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步阐述，但本发明所保护范围不限于 此。
[0032] 实施例1 :克隆得到施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri Qlu3)海藻糖合酶基 因
[0033] 依据NCBI上公开的施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri)海藻糖合酶全长核苷 酸序列设计简并引物，引物序列如下：
[0034] 上游引物：5' -ate gga tcc atg age ahn cca gac aah anc tat atc_3' ；
[0035] 下游引物：5' -tea etc gag tta ran cac egg hgr_3' ；
[0036] 以施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri Qlu3)的基因组为模板，利用上述引物 进行PCR扩增，PCR反应体系如下：
[0037]
【主权项】
1. 一种海藻糖合酶的表达基因，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2. -种海藻糖合酶，氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3. -种插入权利要求1中SEQ ID No. 1所示核苷酸序列的重组载体。
4. 一种转基因细胞系，含有权利要求3所述的重组载体。
5. 权利要求1所述海藻糖合酶的表达基因、权利要求3所述重组载体或权利要求4所 述转基因细胞系在制备海藻糖合酶中的应用。
6. 权利要求2所述海藻糖合酶在制备海藻糖中的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种海藻糖合酶及其编码基因与应用。海藻糖合酶的表达基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；海藻糖合酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明首次由施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri Qlu3)中获得海藻糖合酶，该海藻糖合酶制备方法简便，产量大，纯度高；实验证实其热稳定性好，反应1h海藻糖转化率即可达到70％，较现有的海藻糖合酶反应时间大大缩短，可以降低海藻糖的生产成本，为海藻糖的工业化生产奠定了基础。
【IPC分类】C12P19-12, C12N1-21, C12N15-70, C12P19-24, C12N9-90, C12N15-61
【公开号】CN104805104
【申请号】CN201510259316
【发明人】苏静, 王瑞明, 李珍珍, 张云霄
【申请人】齐鲁工业大学
【公开日】2015年7月29日
【申请日】2015年5月19日