一种生产β-胡萝卜素的方法及其基因工程菌的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种生产β -胡萝卜素的方法及其基因工程 菌。
【背景技术】
[0002] β_胡萝卜素属于萜类化合物，是类胡萝卜素家族中的一员，在食品、药品、化妆品 和保健品中有着广泛的应用。
[0003] 目前，β -胡萝卜素的生产方法有化学合成品的生产及天然品的生产方法，而化学 合成产品全为反式结构，天然品为顺式和反式混合型。化学合成以维生素 A合成过程中的 中间体C14醛、维生素 A为原料开始合成，而天然品的产生方法主要是从天然植物、蚕粪、盐 藻和微生物发酵液中提取。由于人们对β胡萝卜素药理活性的要求，天然品逐渐成为一种 趋势。
[0004] β-胡萝卜素属于萜类化合物，合成萜类化合物的内源性途径主要有甲基赤藓 糖-4-磷酸（MEP)途径和甲羟戊酸（MVA)途径，其中MEP途径主要存在于植物的质体、细菌 和藻类等，MVA途径主要存在于真核生物、古细菌和高等植物的细胞液中。这两类代谢途径 的终产物均是萜类化合物的共同的前体物质二甲基烯丙基焦磷酸（DMPP)和异戊酰焦磷酸 (ΙΡΡ)，之后在β-胡萝卜素合成基因存在下合成β-胡萝卜素。
[0005] 微生物具有生产快、发酵周期短、遗传背景清晰、易于工程化操作等优点。近年来 随着合成生物学的不断发展，人们对利用基因工程生产β-胡萝卜素进行了广泛的研究， 主要是针对单个基因进行调控，过表达MEP途径中的单个基因，来提高β-胡萝卜素的产 量。但是这些方法操作复杂，菌株稳定性较差。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的技术问题是针对现有的生产β胡萝卜素的方法操作复杂，稳定 较低的问题，提供一种生产β_胡萝卜素的方法及其所用的大肠杆菌基因工程菌。
[0007] 本发明的技术方案之一是：一种生产β -胡萝卜素的方法，包括以下步骤：培养大 肠杆菌基因工程菌，从发酵液中获得胡萝卜素，所述的大肠杆菌基因工程菌是含有外 源的含四个胡萝卜素合成基因的表达载体的大肠杆菌，该四个胡萝卜素合成基因 分别是：crtE(栊牛儿基栊牛儿基焦磷酸合成酶基因)、crtB(茄红素合成酶基因)、crtl(番茄 红素合成酶基因)和crtY ( β-胡萝卜素合成酶基因），其中，所述的大肠杆菌基因工程菌还 含有含四个MEP途径基因的表达载体，该四个MEP途径基因分别是：dxs(脱氧木酮糖-5-磷 酸合成酶基因 )、idi (异戊酰基焦磷酸异构酶基因 )、ispD (4-二磷酸胞苷甲基-D-赤藓糖 醇合成酶基因）和ispF (2-甲基-D-赤藓糖醇-2, 4-环二磷酸合成酶基因）。
[0008] 本发明所述的大肠杆菌基因工程菌的培养方法同常规的大肠杆菌培养方法，包括 接种于LB培养基中进行培养，培养至菌体浓度至诱导浓度时加入诱导剂IPTG，即表达导入 的外源基因，从而产生β-胡萝卜素。然后从发酵液中获得β-胡萝卜素。从发酵液中获 得β-胡萝卜素的方法是本领域的常规方法。
[0009] 本发明的技术方案之二是：一种高产β_胡萝卜素的大肠杆菌基因工程菌，所述 的大肠杆菌基因工程菌是含有外源的含四个胡萝卜素合成基因的表达载体的大肠杆 菌，该四个β -胡萝卜素合成基因分别是：crtE、crtB、crtl和crtY，并且，所述的大肠杆菌 基因工程菌还含有含四个MEP途径基因的表达载体，该四个MEP途径基因分别是：dxs、i di、 ispD 和 ispF〇
[0010] 本发明所述的大肠杆菌基因工程菌含有含四个MEP途径基因的表达载体。大肠杆 菌原基因组中含有上述四基因，通过外源的该四基因的导入，增加大肠杆菌上述四基因的 拷贝数。
[0011] 本发明所述的含四个MEP途径基因的表达载体，能够在大肠杆菌中表达该四基 因。较佳的，所述的含四个MEP途径基因的表达载体的载体骨架是质粒pTrcHis2B或者质粒 pET32a(+)，更佳的是质粒pTrcHis2B。质粒pTrcHis2B的启动子是trc，pET32a(+)的启动 子的是17,其中trc是弱启动子，T7是强启动子。一般而言，强启动子有利于重组蛋白的表 达，可能有利于产物的产生，弱启动子不利于重组蛋白的表达，也就不利于产物的产生。本 发明在做了多次重复试验后，发现pTrcHi S2B中的的启动子trc虽然是弱启动子，但是相比 于pET32a(+)的强启动子T7,更加利于β-胡萝卜素的产生。
[0012] 本发明中，所述的含四个β-胡萝卜素合成基因的表达载体含有四个β-胡萝卜 素合成基因：crtE、crtI、CrtB和CrtY。较佳的，所述的表达载体含有包括该四基因的β-胡 萝卜素合成基因簇。优选的是本领域常规的β_胡萝卜素合成基因簇，更优选来自成团泛 菌CGMCC NO. 1. 2244的β -胡萝卜素合成基因簇。如本领域常规，β -胡萝卜素合成基因 簇也称为crt基因簇，包含的基因有crtE、crtl、crtB和crtY。
[0013] 本发明所述的含四个β-胡萝卜素合成基因的表达载体能够在大肠杆菌中表达 该四基因。较佳的所述的含四个β-胡萝卜素合成基因的表达载体是质粒pACYC184-M-crt (参见文献：赵婧，刘怡，李清艳等.多个调控元件调控萜类合成途径基因表达提高β-胡 萝卜素的生产[J].生物工程学报，2013, 29(1) :41-55.)。
[0014] 采用上述两个表达载体转化大肠杆菌即获得所述的大肠杆菌基因工程菌。所述的 转化的方法是常规的，采用常规方法转化大肠杆菌感受态细胞即可。
[0015] 本发明所述的大肠杆菌是本领域常规的表达外源基因的宿主微生物，优选大肠杆 菌 BL21 (DE3)。
[0016] 所述的大肠杆菌基因工程菌的一较佳构建方法包括：
[0017] (1)上游质粒 pET32a(+)-dxs-idi_ispDF 构建：
[0018] ①以大肠杆菌基因组为模板，根据载体pET32a(+)设计的酶切位点，通过PCR获得 目的片段dxs、idi和ispDF ;
[0019] ②利用酶切连接的方法，将目的片段dxs、idi和ispDF导入载体pET32a(+)中，从 而构建上游质粒 pET32a(+)-dxs-idi_ispDF ;
[0020] (2)上游质粒 pTrcHis2B-dxs-idi_ispDF 构建：
[0021] ①以大肠杆菌基因组为模板，根据载体pTrCHis2B设计酶切位点，通过PCR获得目 的片段 dxs、idi 和 ispDF ;
[0022] ②利用酶切连接的方法，将目的片段dxs、idi和ispDF导入载体pTrcHis2B中，从 而构建上游质粒 pTrcHis2B-dxs-idi_ispDF ;
[0023] (3)下游质粒 pACYC184-M-crt 构建：
[0024] 下游质粒pACYC184-M_crt为已知的，参见文献：赵婧，刘怡，李清艳等.多 个调控元件调控萜类合成途径基因表达提高β_胡萝卜素的生产[J].生物工程学 报，2013, 29(1) :41-55。质粒pACYC184-M-crt具体构建方法包括：以成团泛菌CGMCC NO. 1.2244基因组为模板，扩增β-胡萝卜素合成基因簇crtEXYIB，然后连接到载体 PACYC184中，将该质粒导入感受态细胞大肠杆菌DE3中，由于大肠杆菌中本身含有内源性 的MEP途径，故重组菌株pACYC184-M-crt (DE3)可以产生β-胡萝卜素，但是含量比较低；
[0025] (4)重组菌株 pET32a(+)-dxs-idi-ispDF-pACYC184-M-crt (DE3)构建：
[0026] 将上游质粒pET32a(+)-dxs-idi_ispDF和下游质粒pACYC184-M_crt同时导入感 受态细胞中，筛选具有双抗的阳性转化子；
[0027] (5)重组菌株 pTrcHis2B-dxs-idi-ispDF-pACYC184-M-crt (DE3)构建：
[0028] 将上游质粒pTrcHis2B-dxs-idi_ispDF和下游质粒pACYC184-M_crt同时导入感 受态细胞中，筛选具有双抗的阳性转化子；
[0029] (6 )阳性转化子发酵验证
[0030] 重组菌株 pACYC184-M-crt (DE3)、pET32a(+)-dxs-idi-ispDF-pACYC184-M-crt (DE3)和 pTrcHis2B-dxs-idi-ispDF-pACYC184-M-crt(DE3)同时进行发酵，检测其中 β -胡 萝卜素产量。
[0031] 更优选的，所述的大肠杆菌基因工程菌，由包括以下步骤的方法制备而得：
[0032] (1)基因克隆
[0033] 以大肠杆菌K12MG1655基因组DNA为模板进行PCR扩增，得dxs基因，其中PCR所 用引物的序列分别如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示，
[0034] 以大肠杆菌K12MG1655基因组DNA为模板进行PCR扩增，得idi基因，其中PCR所 用引物的序列分别如SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4所示，
[0035] 以大肠杆菌K12MG1655基因组DNA为模板进行PCR扩增，得ispD基因和ispF基 因，其中PCR所用引物的序列分别如SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6所示；
[0036] (2)表达载体构建
[0037] 将胶回收后的dxs基