分子标志物用于乳腺癌诊断和预后评估的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术和医学领域，涉及一种分子标志物用于乳腺癌诊断和预后评估的方法。
[0002]
【背景技术】
[0003]乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，发病率占全身各种恶性肿瘤的7_10%，位居女性恶性肿瘤发病率的第一位。近十几年来我国乳腺癌发病率逐年上升，且发病年龄趋于年轻，已严重威胁我国妇女的健康。乳腺癌作为高度分子异质性疾病，沿用的解剖学分期和组织学分类已不能满足其目前的临床诊治需求，尤其缺少能够标志肿瘤生物学行为并对临床治疗提供指导作用的乳腺癌组织学分类方法。近年来，人们尝试采用各种高通量分子技术方法认识乳腺癌内在本质。目前较为公认的是将乳腺癌分为4个类型，即管腔上皮(表达正常乳腺管腔上皮激素受体、细胞角蛋白和相关基因)A型(Luminal A)、管腔上皮B型(Luminal B，较A型激素受体水平低，组织学级别高)、HER_2过表达型和基底样型(basal-like，表达乳腺上皮基底样或干细胞相关基因)。这4种类型在之后大量的临床研宄中，证实了它们在预后和治疗反应等方面具有特异性。
[0004]S100A8 蛋白(Calgranulin A 蛋白、MRP8 蛋白)与 S100A9 蛋白(Calgranulin B蛋白、MRP14蛋白)均属于妈结合蛋白SlOO蛋白家族成员，两者常以钙离子依赖性方式形成异源二聚体S100A8/A9蛋白复合物(简称S100A8/A9)，在循环中性粒细胞、单核巨噬细胞中表达。可参与炎症反应，调节细胞生长分化，增长抑制，诱导细胞凋亡等。近年来的研宄发现S100A8/A9与多种疾病密切相关，特别是其对于肿瘤性疾病增殖和凋亡的可能作用。但目前尚无其应用于乳腺癌诊断和预后的报道。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种分子标志物用于乳腺癌诊断和预后评估的方法。所述的分子标志物可用于帮助乳腺癌进行基因分型及预后评估。
[0006]本发明所述的技术方案是:
(O对患有乳腺癌的对象进行基因分型测定:从患有乳腺癌的对象获得测试样品；测定S100A8和S100A9在所述测试样品中的表达水平；分析表达水平与乳腺癌基因分型的相关性:乳腺癌基底细胞型(basal-like)和Her_2过表达型(Her_2 amplified)的S100A8和S100A9的表达水平高，而管腔上皮A型(Luminal A)和管腔上皮B型(Luminal B)亚型中表达量较低。
[0007](2)对患有乳腺癌的对象进行预后评估:根据乳腺癌微阵列数据，通过对对象的S100A8和S100A9表达水平进行分组，从而分析表达水平与乳腺癌预后水平的相关性。S100A9的表达水平高的对象预后存活差；S100A9的表达水平低的对象预后存活良好。
[0008]所述的基因分型测定方法为:
1)RNA提取和逆转录
获得乳腺癌患者手术后的组织，分离mRNA，将每个样本I μ g的RNA在20 μ L的体系中逆转录成cDNA ；
2)qRT-PCR
用SYBR法，以cDNA为模板，扩增目的基因S100A8和S100A9，以β -actin基因做内对照；反应体系为25 yL，反应程序为:预变性95°C，1min ；循环95°C，15sec，60°C，lmin，共40个循环；基因相对表达量采用公式2-ΛΛ ct计算，分析目的基因表达量的差异;
所述的分离mRNA，用英骏公司(Invitrogen)的纯化试剂盒、缓冲液组和蛋白酶；
所述的乳腺癌微阵列数据采用的是荷兰癌症研宄所(Netherlands CancerInstitute, NKI)中的发表的乳腺癌微阵列数据。
[0009]本发明的优点是:本发明通过采用乳腺癌标志物S100A8/A9对乳腺癌进行诊断和预后评估具有操作简单、特异性高、灵敏性高的优点。
[0010]
【附图说明】
[0011]图1为NKI陈列中不同类型的乳腺癌基因分型的S100A8和S100A9的表达水平。
[0012]图2为基因表达相关性分析，其中(A)为S100A8和ESRl (雌激素受体alpha)；(B)为 S100A8 和 GATA-3 ； (C)为 S100A9 和 ESRl (雌激素受体 alpha) ； (D)为 S100A9 和GATA-3。
[0013]图3为根据NKI数据库中乳腺癌患者的S100A8和S100A9表达水平分组后的Kaplan-Meier存活分析曲线。
[0014]图4为qRT-PCR引物序列。
[0015]
【具体实施方式】
[0016]现结合附图及具体实施例对本发明作进一步的说明。
[0017]如图所示，本发明实施的具体步骤为:
(O对患有乳腺癌的对象进行基因分型测定:从患有乳腺癌的对象获得测试样品；测定S100A8和S100A9在所述测试样品中的表达水平；分析表达水平与乳腺癌基因分型的相关性:
从图1A中可见:S100A8的表达水平在Her2+/basal-like分型的乳腺癌对象中表达水平较高，而在Luminal A/B分型的乳腺癌患者中表达水平较低(P〈0.001)。图1B中可见S100A9的表达水平在Her2+/basal_like分型的乳腺癌对象中表达水平较高，而在LuminalA/B分型的乳腺癌患者中表达水平较低(P〈0.001)。
[0018](2)对患有乳腺癌的对象进行预后评估:根据乳腺癌微阵列数据，通过对对象的S100A8和S100A9表达水平进行分组，从而分析表达水平与乳腺癌预后水平的相关性；S100A9的表达水平高的对象预后存活差；S100A9的表达水平低的对象预后存活良好。
[0019]具体相关结果为:
从图3A、3B中可见:根据S100A8/S100A9表达水平分组的Kaplan-Meier存活分析曲线中可以看出，S100A9表达水平与总生存率存在显著的负相关(P〈0.05) ;S100A8表达水平与总生存率相关性不明显。
[0020]从图3C、3D中可见:根据预后情况分组的S100A8/S100A9表达水平均存在显著差异(P〈0.001)，提示S100A8/S100A9表达水平可以作为乳腺癌的预后标志物。
[0021]所述的基因分型测定方法为:
1)RNA提取和逆转录
获得乳腺癌患者手术后的组织，分离mRNA，将每个样本I μ g的RNA在20 μ L的体系中逆转录成cDNA ；
2)qRT-PCR
用SYBR法，以cDNA为模板，扩增目的基因S100A8和S100A9，以β -actin基因做内对照；反应体系为25 yL，在ABI Stepone Plus实时定量PCR仪上进行反应。反应程序为:预变性95°C，1min ；循环95°C，15sec，60°C，lmin，共40个循环；基因相对表达量采用公式2-AAct计算，分析目的基因表达量的差异。
[0022]所述的分离mRNA，用英骏公司(Invitrogen)的纯化试剂盒、缓冲液组和蛋白酶；所述的乳腺癌微阵列数据采用的是荷兰癌症研宄所(Netherlands Cancer Institute,NKI)中的发表的乳腺癌微阵列数据。
[0023]本发明图3中S100A8/S100A9的表达水平与ESRl和GATA-3的表达水平存在显著负相关(p〈0.0001)。
【主权项】
1.一种分子标志物用于乳腺癌诊断和预后评估的方法，其特征在于所述的方法包括: (1)对患有乳腺癌的对象进行基因分型测定:从患有乳腺癌的对象获得测试样品；测定 S100A8和S100A9在所述测试样品中的表达水平；分析表达水平与乳腺癌基因分型的相关性乳腺癌基底细胞型和Her-2过表达型的S100A8和S100A9的表达水平高，而管腔上皮A型(Luminal A)和管腔上皮B型(Luminal B)亚型中表达量较低； (2)对患有乳腺癌的对象进行预后评估:根据乳腺癌微阵列数据，通过对对象的S100A8 和S100A9表达水平进行分组，从而分析表达水平与乳腺癌预后水平的相关性:S100A9的表达水平高的对象预后存活差；S100A9的表达水平低的对象预后存活良好。
2.根据权利要求1所述的分子标志物用于乳腺癌诊断和预后评估的方法，其特征在于所述的基因分型测定方法为: (1)乳腺癌患者组织的mRNA提取和逆转录 获得乳腺癌患者手术后的组织，分离mRNA，将每个样本I μ g的RNA在20 μ L的体系中逆转录成cDNA ； (2)乳腺癌患者组织的qRT-PCR测定 用SYBR法，以cDNA为模板，扩增目的基因S100A8和S100A9，以β -actin基因做内对照；反应体系为25 yL，反应程序为:预变性95°C，1min ；循环95°C，15sec，60°C，lmin，共40个循环；基因相对表达量采用公式2-ΛΛ ct计算，分析目的基因表达量的差异。
3.根据权利要求1所述的分子标志物用于乳腺癌诊断和预后评估的方法，其特征在于所述的分离mRNA，用英骏公司的纯化试剂盒、缓冲液组和蛋白酶。
4.根据权利要求1所述的分子标志物用于乳腺癌诊断和预后评估的方法，其特征在于所述的乳腺癌微阵列数据采用的是荷兰癌症研宄所的发表的乳腺癌微阵列数据。
【专利摘要】本发明涉及一种乳腺癌分子标志物S100A8/A9用于乳腺癌诊断和预后评估的方法。本发明明确了分子标志物S100A8/A9在不同分子病理亚型的乳腺癌患者中表达存在差异，其中在基底细胞型（basal-like）和Her-2过表达型（Her-2 amplified）中高表达，而在管腔上皮A型（Luminal A）和管腔上皮B型(Luminal B)亚型中表达量较低，有显著统计学差异。对已发表的NKI乳腺癌芯片数据，基于S100A8/A9的将病人分为高低两组进行Kaplan-Meier生存曲线分析，显示S100A9表达水平和总生存率存在显著负相关，提示高表达S100A9的乳腺癌患者预后差，具有提示乳腺癌的预后的应用价值。
【IPC分类】C12Q1-68
【公开号】CN104805197
【申请号】CN201510165402
【发明人】鲍轶, 王安涛, 莫娟芬, 郑丽
【申请人】嘉兴市第二医院
【公开日】2015年7月29日
【申请日】2015年4月9日