一种基于合成单链dna文库进化代谢途径的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种基于合成单链DNA文库进化代谢途径的方法，属于基因工程技术 领域。
【背景技术】
[0002] 随着分子生物学技术和基因工程技术的发展，已有数千种类的天然酶基因被发 现，由于酶介导的生物催化具有环境友好型，高效专一性和反应条件温和等优点，作为生催 化的主导者，被广泛应用于复杂的药物、中间体、化合物的合成，甚至生物燃料的合成。合成 生物和代谢工程中酶是核心的参与者，通过构建一系列的代谢合成途径，可以实现微生物 代谢合成各种有机合成无法获得的复杂化合物，如芳烃、碳水化合物、有机酸、醇和其他次 级代谢产物。然而，在大多数情况中，天然酶的性质的局限性，极大地限制了它在各种复杂 条件下的使用。
[0003] 自然界在遗传突变与自然选择的动态平衡过程中，进化出了非常精确且又高效的 酶，然而自然选择的速度非常缓慢，需要漫长的时间。人们迫切需要对天然酶进行人工进化 和改造，以期获得能够满足人们需求的功能更强大的新酶。在当今实验技术条件下，人们通 过物理化学等方法，例如紫外、射线和亚硝酸盐等极大地提高了基因突变的频率，为人工快 速进化基因提供了可能。然而，物理化学等方法造成的突变往往都是有害突变，且随机性较 大，还无法满足大规模的进化需求。随着分子生物学技术的日趋成熟，从基因操作水平上直 接对天然基因引入特定的或随机的突变位点已成为可能。随机突变方法是通过引进随机的 碱基替换，进而筛选理想的突变体。例如易错PCR技术，是目前使用较广的基因进化方式之 一，通过在体外聚合酶链反应（PCR)过程中随机引入突变点，高通量筛选有益进化的基因。 经过多轮次操作后，可以获得酶学性质和功能发生明显变化的新酶。在此基础上发展起来 的各种依赖PCR技术引入突变点进化基因的技术如定点突变、基因嵌合以及瞬时模板的随 机嵌合等方法。然而，上述方法产生的突变点多样性少，产生的突变体也多为有害突变，工 作量大而且效率极低。
[0004] 1994年，一种的定向进化新技术DNA改组（DNA shuffling)悄然诞生，Stemmer在 Nature发表了一篇题为Rapid evolution of a p rotein in vitro by DNA shuffling的 文章，首次提出了 DNA改组技术。研宄者以β-内酰胺酶系统为试验对象，运用DNA改组， 经过三轮筛选和两次回交得到一新菌株，其头孢噻H亏（cefotaxime)的最低抑制浓度比原 始菌株提高了 16000倍，远高于错误倾向PCR的突变筛选结果。随后发展起来的各种以重 组技术为基础的方法，以提高基因杂交的程度和筛选效率为目标，都获得了比较好的效果。 然而，DNA shuffling技术对序列同源性的要求较高（同源性大于75% )且需要获取同源 基因材料。这两个条件极大限制了 DNA shuffling技术的应用，同时该技术产生的突变体 往往有较多的移码突变体。
[0005] 此外，当前合成生物学和代谢工程对合成途径的改造基本都注重在对合成途径基 因的表达调控上，例如增强途径基因的表达，敲除或者抑制竞争途径，例如优化启动子或者 核糖体结合位点，优化基因的密码子，改造途径基因的间隔调控区域等。另外，对合成途径 中的酶进行改造也是非常有必要的，例如关键酶的限速问题、受产物或者底物反馈抑制。因 为，如果仅仅加强表达水平，可能会导致细胞合成能力的浪费和细胞生长负担，而不能从根 本上解决代谢途径流量平衡的问题。
[0006] 本发明采用体外PCR重组技术为基础，通过人工合成单链DNA文库，采用PCR技术 获得含有多样性极其丰富的突变文库，再采用体外重组技术构建突变筛选文库。此技术克 服了上述随机突变多样性不足、DNA shuffling技术同源序列和同源基因材料的限制等因 素，而且操作实施简单，易于获得丰富的突变体文库，为基因体外快速进化奠定了基础，同 时，结合蛋白结构生物信息学和合成生物学，特别适合于酶基因和代谢合成途径的快速定 向进化应用。
【发明内容】
[0007] 本发明提供了一种基于合成单链DNA文库进化代谢途径的方法（Rapidly Efficient Combinatorial Oligonucleotides for Direct Evolution，RECODE)，主要包 括制备突变体文库、筛选突变体；所述突变体文库包括单链突变体文库和双链突变体文库。 单链突变体文库与双链突变体文库可以分开构建，也可以同步构建。为构建单链突变体文 库，针对亲本基因的各个目标突变区域分别设计引物，各引物方向相同，并通过向PCR体系 中添加 DNA连接酶来连接各发生突变的核苷酸片段，得到完整的单链突变体；为构建双链 突变体文库，单链突变体的两端需带上额外的锚点序列，便于在双链化时，设计用于特异性 扩增单链突变体的引物。
[0008] 所述目标突变区域可以是有目的地选择得到的或随机产生的。对一条链上进行同 时突变的区域数量在理论上不受限制，实际操作中可根据需要自行设定，2k以内的基因可 以在1-15个位点之间。
[0009] 所述方向相同，是指各引物均为3'至5'方向，或均为5'至3'方向。当亲本基因 是双链DNA时，引物方向相同可以保证PCR过程仅以特定方向的DNA链为模板，最终得到单 链突变体。
[0010] 所述亲本基因编码的是代谢途径基因，包括启动子、核糖体结合位点和途径酶基 因；亲本基因的存在形式不受限制，可以为质粒、基因组、双链DNA片段或者单链cDNA。
[0011] 所述单链突变体文库和双链突变体文库同步构建，是直接向构建单链突变体文库 的PCR体系中添加特异结合单链突变体的引物，边PCR获得单链突变体，边以单链突变体为 模板进行双链化反应和双链突变体的扩增反应。
[0012] 所述单链突变体文库和双链突变体文库分步构建时，直接以含单链突变体文库的 PCR混合产物作为模板，不更换反应体系，直接向其中加入特异结合单链突变体的引物进行 第二轮PCR制备全长完整的双链突变体；或者以经柱纯化回收后的单链突变体文库作为模 板，重新配制反应体系进行第二轮PCR制备全长完整的双链突变体。
[0013] 为构建单链突变体文库，针对亲本基因的一个或多个目标突变区域，分别设计相 应的引物，称为编辑引物。所述编辑引物含有需要向突变区域引入的突变碱基且3'和5' 端分别有适当长度的与模板链匹配的序列；涉及多个突变区域时，各编辑引物为同方向，均 与同一方向模板链配对结合。同时，合成两条与编辑引物同方向的锚点引物，其中一条是上 游锚点引物，一条是下游锚点引物，所述上游锚点引物含有一段与模板链3'端匹配的核苷 酸序列，此外，该上游锚点引物的5'端还有15-25bp的锚点序列；所述下游锚点引物含有一 段与模板链5'端匹配的核苷酸序列，此外，该下游锚点引物的3'端还有15-25bp的锚点序 列。
[0014] 对于编辑引物，为节省合成费用，一般建议编辑引物长度低于59bp，若有需要可增 加引物长度，或者可分为两条短引物。需要进行突变的位点一般置于编辑引物的中间部位， 根据需要可进行高度简并，若亲本编码的是蛋白序列，为避免终止密码子TAA、TAG和TGA出 现，三联密码子可简并为VNN或者降低终止子出现的概率，编辑引物合成优选PAGE纯化方 式。
[0015] 所述锚点引物，还可以兼具编辑引物的功能，即在作为锚点引物的同时，还可以含 有需要向突变区域引入的突变碱基。
[0016] 所述锚点序列，一方面可以在构建双链突变体文库时，用于设计专一与单链突变 体结合的外端引物，另一方面还可作为同源重组序列，用于突变体文库与表达载体的连接。 在将双链突变体与载体连接时，不建议使用限制性酶切位点进行重组载体，因为高度简并 的突变引入，可能会使基因内部出现相应的酶切位点。
[0017] 所述需要在突变区域引入的突变碱基可以是具体的碱基序列，也可以是简并碱基 序列。
[0018] 所述编辑引物和下游锚点引物，在使用前先采用T4多聚核苷酸激酶对引物的5' 端羟基进行磷酸化反应。
[0019] 所述编辑引物的3'和5'端序列分别保留15-30bp的与模板完全匹配的寡聚核苷 酸序列。
[0020] 制备单链突变体文库的反应过程是DNA延伸和DNA连接同步进行的反应：上、下游 锚点引物、编辑引物与模板DNA以适当摩尔比混合，添加 DNA聚合酶和DNA连接酶，反应缓 冲液。反应缓冲液中Mg2+浓度为1-lOmM，PCR退火温度为40-66 °C，PCR延伸温度为65-72°C， PCR反应循环数为1-35个。PCR产物中包括变性解链后未用作模板的单链DNA、大量的发生 突变的单链DNA、与模板结合着的处于双链状态的发生突变的DNA链。
[0021] 在本发明的一种实施方式中，制备单链突变体文库时，与模板链不同位置结合的 引物的摩尔数相同。
[0022] 为构建双链突变体文库，可以以含单链突变体文库的PCR混合物或者经柱纯化回 收后的单链突变体文库作为模板，进行第二轮PCR制备全长完整的双链突变体文库；或者 直接向构建单链突变体文库的反应体