通过在低ph下发酵产生有机酸的制作方法
【专利说明】通过在低PH下发酵产生有机酸
[0001] 相关申请的交叉参考
[0002] 该申请要求保护2012年9月14日提交的美国临时申请系列号61/701，293的优 先权。 发明领域
[0003] 本发明是使用生物催化剂产生可再生化学原料的领域，已经遗传改造了所述生物 催化剂以增加其将可再生碳源转化成有用的化合物的能力。更尤其是，本发明提供使用遗 传修饰的生物催化剂从可再生碳源产生有机酸，如琥珀酸、延胡索酸、苹果酸和乳酸的方 法。
[0004] 发明背景
[0005] 琥珀酸（为了简洁，本文中也称为"琥珀酸"）是在多种产品，包括动物饲料、增塑 剂、冷冻剂、聚合物、纤维和塑料，最特别的是聚琥珀酸丁酯（也称为"聚琥珀酸亚丁酯"、"聚 (琥珀酸亚丁酯）"和"PBS"）的制造中早已使用或可能使用的潜在大体积化学物。由琥珀 酸制备的许多聚合物以比来源于石油的其他聚合物，如聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯和聚对苯 二甲酸乙二酯（PET)快得多的速率被生物降解。像这样，由琥珀酸制备的塑料是高度想要 的，因为它们在垃圾或其他堆肥环境中会更迅速地腐烂（Kunioka等，2009)。这种性质扩展 至许多其他聚合物和塑料，其中单体亚基是生物来源的化合物或其化学等同物，而不是正 常在活生物体中没有大量发现的石油化学来源的化合物。例如，来源于延胡索酸（延胡索 酸）、苹果酸（苹果酸）、己二酸（己二酸）、L-乳酸（L-乳酸）、D-乳酸（D-乳酸），和其他 天然发生的有机酸的聚合物均比堆肥环境中的许多石油化学来源的聚合物降解地更迅速。 像这样，为了人类的利益，期望利用由生物化学物（由活生物体制备和/或代谢的化学物） 制备的聚合物和塑料替换目前由石油化学物制备的聚合物和塑料。
[0006] 当然，可以从石油制造许多生物化学物，如琥珀酸、延胡索酸，和己二酸，并且实际 上，目前使用的制备PBS和尼龙的方法（2012)使用石油来源的单体。然而，因为世界石油供 应是有限的，还期望开发通过从可再生碳源，如糖、糖聚合物、甘油、脂肪酸、二氧化碳、木质 素或生物量的任何其他形式或来源于生物量的废物发酵产生生物化学单体的材料和方法。 因此，期望开发从可再生生物资源制备生物可降解塑料的方法。
[0007] 已经开发了若干方法用于通过发酵产生有机酸，例如通过乳杆菌 (Lactobacillus)、埃希氏菌（Escherichia)和芽抱杆菌（Bacillus)属的细菌产生L-乳 酸（Grabar等，2006 ;Patel等，2006)，通过丝状真菌米根霉（Rhizopus oryzea)产生 延胡索酸（Roa Engel等，2008)，通过遗传改造的大肠杆菌（Escherichia coli)或凝 结芽抱杆菌（Bacillus coagulans)产生 D-乳酸（Wang 等，2011 ;Jarboe 等，2010 ; Grabar等，2006)，通过遗传改造的大肠杆菌（E. coli)产生己二稀二酸（Niu等，2002)， 通过酵母（Saccharomyces)、克鲁维酵母（Kluyveromyces)、假丝酵母（Candida)和伊 萨酵母（Issatchenkia)属的多种遗传改造的酵母种产生L-乳酸（Zhang等，2011 ;US 7,049，108，US 7, 229, 805)，通过遗传改造的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)产 生苹果酸（US 2008/0090273)，和通过遗传改造的大肠杆菌、酿酒酵母、东方伊萨酵母 (Issatchenkia orientalis)和解脂耶氏酵母（Yarrowia Iipolytica)产生瑭泊酸（Zhang 等，2009a ;Zhang 等 2009b ;Jantama 等，2008a ;Jantama 等，2008b ;W0 2010/003728 ;W0 2008/128522 ;W0 2010/043197 ;W0 2012/103261 ;US2012/0015415)。
[0008] 许多上述方法，包括基于细菌的所有那些使用不能在低pH下生长的生物体。如本 发明中所用，术语"低pH"定义为5. 6或更低的pH。当低pH不耐受的生物催化剂，如细菌 生物催化剂用于产生有机酸，如琥珀酸时，培养基的pH变成酸性的并且通过加入碱，一般 是钠、钾、铵、镁或钙的氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐或其混合物将pH维持在约5. 6至约7. 5。 因此，培养液中的有机酸以盐存在，并且大多数有机酸分子是带电荷的。荷电状态具有优点 和缺点。优点是荷电盐不轻易地穿过细胞膜弥散回到细胞内。缺点是有机酸的聚合化学或 其他进一步的化学用途一般需要有机酸的质子化形式（也称为"游离酸"），所以发酵产生 的盐需要可能昂贵的下游处理来提供游离的酸形式。像这样，在低PH(接近或更优选低于 有机酸的最低PKa的pH)下产生有机酸将是有利的，从而大多数分子处于游离酸状态。将 其他考虑因素放在一边，低PH发酵液处理较廉价以给出游离酸的纯制剂，因为必须分离的 平衡离子（如钠、钾、铵、镁、钙）少得多。然而，该方法遇到的问题至少在理论上是质子化 的酸比其各自的盐更疏水，所以所述质子化的酸更易于通过细胞膜的疏水脂双层弥散回到 细胞内（van Maris等，2004)。如果需要能量将有机酸泵出细胞，那么接着发生无效循环， 其会消耗细胞的资源远离想要的生物合成（van Maris等，2004)。
[0009] 但是，存在通过在低pH发酵产生有机酸的方法。最有名且最古老的是通过黑曲 霉（Aspergillus niger)和相关种产生梓檬酸的方法（Papagianni, 2007)，尽管梓檬酸可 能是特例，因为质子化形式可能比一羧酸和二羧酸的质子化形式更极化。近期，已经开发了 方法用于通过多种酵母在pH下产生L-乳酸，并且这些酵母之一已经商业化，尽管还未揭示 是哪一种酵母（Aker 等，Session Abstract 170, Society for Industrial Microbiology Annual Meeting, July 24-28, 2011，New Orleans, LA, USA)。已经改造了 酿酒酵母菌株 以产生苹果酸，但是pH维持在5 (Zelle等，2008)。甚至更近期，已经遗传改造了酿酒酵 母、东方伊萨酵母（Issatchemkia orientalis)和解脂耶氏酵母菌株以在相对低的pH下 产生琥珀酸（W0 2008/128522 ;TO 2010/043197 ;US 2012/0040422 ;TO 2010/003728 ;W0 2011/023700 ;W0 2009/101180 ;W0 2012/038390 ;W0 2012/103261;和 US 2012/0015415)。 然而，当提及时，在这些现有技术专利申请中已经发表的滴度和产量相比于通过在中性pH 下操作的细菌产生系统获得的那些相对低，所以来自发表的酵母方法的滴度和产量足够的 高以与中性pH细菌方法竞争并不明显（Jantama等2008a ;Jantama等，2008b)。此外，如 本发明所公开，在从腐烂的甘蔗渣和其他环境中存在若干酵母菌株，其在低PH下比酿酒酵 母菌株更耐受琥珀酸和L-乳酸。
[0010] WO 2012/103261公开了已经被改造以产生琥珀酸或苹果酸的东方伊萨酵母菌株。 这些菌株来源于在许多不同酵母种类的集合中被选择为在低PH对高浓度的琥珀酸最有抗 性的野生型亲本。具体而言，当与马克思克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus)菌株相 比时，所选的东方伊萨酵母（I. orientalis)菌株对琥珀酸更有抗性。WO 2012/103261没有 公开被改造以过量产生琥珀酸的克鲁维酵母属的酵母。然而，如本发明将公开，本发明人已 经发现了马克思克鲁维酵母的新野生型菌株，其在富含稀释剂的培养基中生长时比东方伊 萨酵母菌株在低pH下对琥珀酸更耐受（参见图1)。因此，种类内不同菌株之间在低pH下 对有机酸的耐受性方面明显地存在一些变异，并且完成筛选的精确条件可能影响该筛选的 结果。例如，在将东方伊萨酵母鉴定为对琥珀酸最耐受的WO 2012/103261中筛选对琥珀酸 的耐受性推测在YH)培养基（含有2%葡萄糖作为碳源），pH 2.5下完成，而在将野生马克 思克鲁维酵母（K. marxianus)菌株（其与马克思克鲁维酵母的任何已知菌株不同）鉴定为 对琥珀酸最耐受菌株的下文中公开的筛选在含有5%葡萄糖的1/4强度YP培养基（2. 5g/l 酵母提取物加5g/l蛋白胨）中和3. 3的起始pH下完成。WO 2012/103261公开了缺失编码 PEP羧激酶的PCK基因对琥珀酸产生有益，因为一般认为PEP羧激酶是葡萄糖异生酶，并在 想要方向的反方向起作用。然而，在适当改造的菌株中，本发明人提出了完全相反的方面， BP，使用PEP羧激酶用于回补（二氧化碳掺入）反应比使用如WO 2012/103261中要求的丙 酮酸羧化酶或PEP羧化酶更有利。WO 2012/103261的发明人提出通过增加戊糖磷酸途径流 量而提供用于产生琥珀酸的还原途径的还原当量。相反，本发明人建议用于琥珀酸合成的 还原当量最好通过TCA循环的氧化和还原分支平衡流来提供。
[0011] 已经公开了东方伊萨酵母的菌株，其已经被改造以产生苹果酸或延胡索酸（W0 2012/103263)。然而，WO 2012/103263没有公开克鲁维酵母作为产生苹果酸或延胡索酸的 宿主的用途，并且如上用于WO 2012/103261，其教导反对使用PEP羧激酶用于从PEP至草酰 乙酸（OAA)的羧化反应。
[0012] 在任何情况下，TO 2102/103261中公开的琥珀酸产生参数和TO 2012/103263中 公开的苹果酸产生参数分别对琥珀酸或苹果酸的商业生产不足以有吸引力，所以仍有改善 的空间，并且仍然需要开发改善的方法用于在低PH下通过发酵产生琥珀酸和其他有机酸， 如延胡索酸、L-苹果酸、D-乳酸、L-乳酸。
[0013] 酿酒酵母当在作为碳源的葡萄糖上需氧或厌氧生长时天然产生大量的琥珀 酸（〇11四，1977;]^61(16和1^(1161'，1978;(16 1(161^1^2010)。在酵母中产生瑭泊酸的氧 化和还原生物化学途径是众所周知的（de Klerck，2010)并且与大肠杆菌和许多其他 生物体的那些类似，除了在酵母中，许多氧化步骤主要在线粒体或原线粒体（也称为 protomitochindria)内被催化。琥泊酸是克雷伯氏循环，也称为三羧酸循环或TCA循环 中的中间物。在存在氧气的条件下，大多数需氧生物体氧化运行TCA循环，其以草酰乙酸 (OAA)和乙酰-CoA开始，运行经过柠檬酸、乌头酸、异柠檬酸、α -酮戊二酸、琥珀酰-CoA、 琥珀酸、延胡索酸、苹果酸并回到0ΑΑ。在该方法中，产生NADH、NADPH和FADH2形式的还原 当量，和2摩尔的CO 2/摩尔乙酰-CoA。因此，乙酰-CoA的乙酰基部分在循环中实际上被氧 化成CO2和水，并且OAA作为获得再生的引物或催化剂而起作用。琥珀酸是中间物。在需氧 条件下，还原当量最终通过氧化磷酸化被氧气氧化，以产生水和ATP，因此，再生NAD、NADP 和FAD用于下一个循环。然而，在缺少氧气或其他氧化剂的情况下，TCA循环不能在上述氧 化循环中专一运行，因为细胞不能再生TCA循环所需量的NAD、NADP和FAD。虽然在基本培 养基中厌氧条件下，需要至少三个TCA循环中间物α -酮戊二酸、琥珀酰-CoA和OAA作为 其他生物合成途径的生物化学中间物，但是大多数TCA循环的酶反应物必须仍然是有活性 的。在这些条件下，将TCA"循环"分成两个线性的非环形的叉或分支，一个氧化分支如上所 述开始，但以琥珀酰CoA终止，和一个还原分支也以OAA开始，但以与上述方向相反的方向， 通过苹果酸和延胡索酸运行，以琥珀酸终止。该第一个分支在本文中应该称为氧化分支，而 第二个分支在本文中应该称为TCA循环的还原分支，因为作为从OAA到琥珀酸的途径之一， 其消耗作为NADH和FADH2的还原当量，以再生NAD和FAD。
[0014] 如在本发明中所定义，术语TCA循环的"产生琥珀酸的氧化途径"或"氧化分支"指 克雷伯氏循环的一部分，其以磷酸烯醇丙酮酸开始并以琥珀酸终止，并且包括中间物如草 酰乙酸、乙酰CoA、柠檬酸、顺乌头酸、异柠檬酸、α -酮戊二酸和琥珀酰CoA，并涉及还原当 量如NADH的产生。另一方面，如本发明中所定义，术语TCA循环的"产生琥珀酸的还原途 径"或"还原分支"指克雷伯氏循环的一部分，其以草酰乙酸开始并以琥珀酸终止，包括作为 中间物的苹果酸和延胡索酸并消耗还原当量如NADH和FADH 2。在野生型酵母细胞中，克雷 伯氏循环完全在线粒体中运转。本发明涉及遗传改造的酵母细胞，其中产生琥珀酸的氧化 途径和产生琥珀酸的还原途径完全在细胞质中转运。
[0015] 草酰乙酸在酵母细胞的细胞质中通过丙酮酸或磷酸烯醇丙酮酸的羧化反应产生。 丙酮酸羧化成草酰乙酸由丙酮酸羧化酶介导，而磷酸烯醇丙酮酸的羧化由磷酸烯醇丙酮酸 羧化酶或磷酸烯醇丙酮酸羧激酶介导。草酰乙酸从细胞质进入线粒体并起始克雷伯氏循 环。
[0016] 来自异柠檬酸（克雷伯氏循环的氧化部分中的中间物）的碳也进入乙醛酸循环， 导致在细胞质中形成乙醛酸和琥珀酸。乙醛酸循环在本领域中也称为乙醛酸旁路。乙醛 酸途径在线粒体中从柠檬酸循环中分支出来并导致在细胞质中作为终产物的琥珀酸的产 生。已经作出努力以在琥珀酸产生中开发乙醛酸途径。为了在细胞质中通过运转乙醛酸循 环来积累琥珀酸，必须实现以下三个遗传操作：（i)在适当位置上阻断柠檬酸循环的运转， 以便来自柠檬酸循环的碳再次导入乙醛酸循环；（ii)增强参与乙醛酸循环的酶的运转；和 (iii)通过遗传操作在线粒体包被中去除二羧酸转运蛋白来阻止琥珀酸从胞质溶胶再次进 入线粒体。
[0017] 本发明的目标是在线粒体外没有乙醛酸循环参与的情况下产生琥珀酸。这通过在 酵母细胞的细胞质内表达一般在线粒体内表达的并且参与克雷伯氏循环的氧化或还原部 分的那些酶来实现。
[0018] 已经遗传改造了大肠杆菌（E. coli)菌株以在厌氧或微需氧条件下产生琥珀酸 (Jantama等，2008a ;Jantama等，2008b)。理论上，为了从葡萄糖实现琥?自酸的最大可能 产量，必须通过TCA循环的氧化和还原分支合成琥珀酸（W02011/063157)。还原途径比氧 化途径固有地从葡萄糖更高地产出，因为所述还原途径并不丢失任何碳原子，并且其在PEP 羧激酶反应中从二氧化碳掺入碳原子。然而，因为还原途径需要一个NADH和一个FADH2/^! 珀酸，并且因为从葡萄糖到PEP的糖酵解途径仅产生一个NADH/3个碳单位，因此从葡萄糖 到琥珀酸的还原途径不是氧化还原平衡的，并因而不能通过自身厌氧运转。氧化途径每消 耗3个碳单位（如丙酮酸）产生两个NADH和一个NADPH。因而，如果还原和氧化途径以正 确的比例运转，那么即使在缺少氧气的情况下也能平衡氧化还原当量（如NADH、NADPH和 FADH2)的产生和消耗。
[0019] 在大肠杆菌中，并且可能在运转TCA循环的大部分或全部其他生物中，TCA的调 节已经很可能进化到保存碳和能量，并且不使琥珀酸从葡萄糖的产量最大化。像这样，使 被改造用于同型发酵琥珀酸产生的大肠杆菌菌株进行"再进化"（也称为代谢进化），其可 能导致平衡TCA循环的两个分支，以在厌氧或微需氧的条件下提供氧化还原平衡（Jantama 等，2008a ;Jantama 等，2008b) ο
[0020] 尽管在酵母低pH发酵中产生二羧酸，如琥珀酸具有理论上的优势，但是由于酵 母中膜结合细胞器形式的亚细胞区室化，在酵母中改造琥珀酸产生几乎不像在大肠杆菌 中那样直接。首先，在酵母中，可能在大多数（如果不是所有）其他酵母中，在需氧条件 下，TCA循环在线粒体或原线粒体内运转（W0 2008/128522, WO 2010/043197)。在缺少 特定的琥?白酸转运蛋白的情况下，线粒体内膜对琥?白酸是不通透的（Lee等，2011)，但是 在延胡索酸或磷酸的交换中将琥珀酸输入到线粒体的转运蛋白是已知的（Lee等，2011 ; Palmieri等，1999 ;Palmieri等，2000)。然而，对于琥?自酸从线粒体分泌到细胞质没有任 何已知的机制，所以从TCA循环，即使是以分支模式产生的琥珀酸也不能轻易地分泌到线 粒体外并因此分泌到细胞外。像这样，现有技术中公认的是，将期望通过在产生苹果酸和 琥珀酸的还原途径中安排关键的酶，如丙酮酸脱酸酶、苹果酸脱氢酶和延胡索酸酶来改造 细胞质中的二羧酸，如苹果酸和琥珀酸，以在线粒体外的细胞质中存在并足够的有活性（US 2008/0090273、US 2012/0040422、WO 2010/003728、WO 2011/023700. WO 2009/101180 和 TO 2012/038390、W0 2008/128522、W0 2010/043197、W0 2009/011974)。然而，现有技术还 未认识到或解决在酵母中怎样从线粒体输出琥珀酸或怎样在厌氧或微需氧条件下达到氧 化还原平衡，同时使琥珀酸从葡萄糖（或其他碳源）的产量最大化的问题。
[0021] 两个线粒体膜蛋白被报道在酵母中将琥珀酸泵入线粒体中交换磷酸或延胡索酸 (Lee等，2011 ;Palmieri等，1999 ;Palmieri等，2000)。像这样，在本发明的优选实施方案 中，编码那些转运蛋白的任一或两个基因，即DICl (W0 2008/128522)和SFCl将从酵母中缺 失，这与被改造以产生琥珀酸的本发明的酵母的新特征组合。
[0022] 使用酵母或细菌用于琥珀酸生产的现有技术参考依赖于使用乙醛酸旁路来产生 还原当量（如NADH)，以供应还原琥珀酸途径（W0 2009/101180、WO 2008/128522、Vemuri 等，2002 ;Cox等，2006 ;Zhu等，2013)。此外，因为乙醛酸旁路酶异柠檬酸裂解酶和苹果 酸合酶在酵母中是在细胞质中的，所以依赖于使用这些酶在酵母细胞质中合成琥珀酸（W0 2009/101180, WO 2008/128522)。然而，当与使用TCA循环的氧化分支比较时，在细菌或酵 母中使用用于琥珀酸合成的乙醛酸旁路内在更没有效力，因为TCA循环的氧化分支在琥珀 酰-CoA到琥珀酸步骤产生ATP或GTP，而乙醛酸旁路在任何步骤均不产生ATP或GTP。因此， 使用乙醛酸旁路是不经济的，所以有利地避免其用于生物合成琥珀酸和其他二羧酸、TCA循 环中间体及其衍生物。本发明人已经认识到使TCA循环的还原和氧化分支为琥珀酸产生 运转的重要性，并且在酵母中，期望使两个分支在细胞质中运转，并且避免使用乙醛酸旁路 酶。为此，可以通过本领域所熟知的方法从宿主酵母菌株中缺失编码异柠檬酸裂解酶（例 如 ScICLl、ScICL2、KmICLl、IoILCl 及其他）和苹果酸合酶（例如 ScMLSl、ScMLS2、KnMLSl、 IoMLSl，及其他）的基因。
[0023] 具体而言，尽管在现有技术中讨论了平衡还原和氧化途径用于琥珀酸产生的概念 (Jantama等，2008b ;Abbott等，2009)，但是没有现有技术参考文献提示在酵母中将TC