基于染色体重组工程的多功能口服疫苗的制作方法
【专利说明】基于染色体重组工程的多功能口服疫苗
[0001] 相关申请资料
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[0003] 政府利益声明
[0004] 本发明得到政府支持；政府在本发明中具有一些权利。
[0005] 序列表数据
[0006] 本文所附序列表文本在2013年9月12日产生，大小为144千字节，文件名为 "6137FDA9PCT_SEQ_Listing_20130912_ST25. txt"，在此以其全部内容并入本文作参考。
[0007] 发明背景
[0008] 细菌性痢疾及伤寒在发达国家及发展中国家仍是导致发病的重要因素。每年 志贺菌属（Shigella)导致估计>1亿5千万例痢疾，伤寒在>2千7百万的人群中发生 (Bardhan, et al. (2010)Emerging Infec Diseasesl6:1718-1723 ；Crump, et al. (2004) Bulletin of the WHO 82:346-353 ；Crump and Mintz(2010)Clin Infec Diseases 50:241-246 ;WH0(2005)Guidelines for the control of shigellosis…）。志贺菌病 和伤寒每年共导致 >250, 000 例死亡（Bardhan, et al. (2010)Emerging Infec Diseases 16:1718-1723 ;Crump, et al.(2004)Bulletin of the WHO 82:346-353)，表明持续需 要多价疫苗以针对这些疾病起保护作用。重要地，2/3的志贺菌病例发生在5岁以下的 儿童0((^1〇打6七31.(1999)81111.硏10,77:651-666 ;1^6〇11(2008)〇11^.0?111.111作(^· Dis. ,21:313-318)，伤寒在学龄儿童中最常见（Crump and Mintz (2010) Clin Infec Diseases 50:241-246)。
[0009] 志贺菌属包括四个种：痢疾志贺菌（S. dysenteriae)、弗氏志贺菌（S. flexneri)、 鲍氏志贺菌（S. boydii)和宋内氏志贺菌（S. sonnei)，也分别称作血清组A、B、C和D。前 三个种分别基于LPS结构中的不同而进一步分为血清型。在摄取污染的食物或水时，志贺 菌导致大肠急性侵润性感染，典型导致严重腹痛痉挛、发热和痢疾（即<5ml的小体积粪便， 包含粘液、多形核中性粒细胞、坏死组织和血丝）。与痢疾志贺菌和弗氏志贺菌相比，鲍氏 志贺菌和宋内氏志贺菌经常导致较轻的疾病。弗氏志贺菌与发展中国家中大多数地方性感 染相关。宋内氏志贺菌是与在工业化国家中观测到的大多数地方性感染相关的菌种。US ⑶C估计在美国每年发生~450, 000例宋内氏志贺菌疾病，其主要发生在幼儿园。宋内氏志 贺菌在发展中国家如泰国也造成相当大数量的死亡率，在此是~95%志贺菌病所致（Mead et al. (1999) Emerg. Infect. Dis. , 5:607-625 ；Putthasri et al. (2009)Emerg. Infect. Dis.，15:423-432)。痢疾志贺菌血清型I (Sdl)尤为重要，因为其导致严重的痢疾加上溶 血性尿毒症综合征（是由于产生强力细胞毒素志贺毒素所致），典型导致较其它志贺菌菌 种所致感染更高的死亡率。进一步地，Sdl最常见地导致高发病率的大型流行病（World Health Organization(2005)Guidelines for the Control of Shigellosis, Including Epidemics Due to Shigella dysenteriae Type 1，ISBN 924159330X)〇
[0010] 目前，没有得到许可的疫苗可以用于预防志贺菌病的发生。越来越多的志贺菌 属多元抗生素抗性通常阻碍当地的治疗。由此，世界卫生组织认为开发志贺菌病的疫苗 是当务之急。最重要地，全球公共卫生需要疫苗以在地方人群、旅行者和军队中预防志 贺菌病。由于存在大量志贺菌属血清型（MO)，一些研宄人员已经尝试发现大多数血清 型共有的表面抗原（Kaminski et al. (2009)Expert Rev. Vaccines, 8:1693-1704)。尽 管取得重大成就，但是共有的表面蛋白质自身（例如ipaA、B、C、D)不呈现出刺激对于 志贺菌属感染的显著或持续的保护性免疫性。然而，存在保护性免疫性主要针对志贺菌 属血清型特异性LPS 0-抗原的相当多的迹象，表明0-抗原作为疫苗开发的靶位的重 要性（Ferreccio et al. (1991)Am.J. Epidemiol. ,134:614-627 ;DuPont et al. (1972) J. Infect. Dis.，125:5-11 ;DuPont et al. (1972) J. Infect. Dis.，125:12-16) 〇
[0011] 实际上，单独的脂多糖（LPS)已经示出是有效的疫苗抗原以特异性保护免于志贺 菌病。先前已经报道了异源LPS生物合成基因的质粒克隆及在宋内氏志贺菌或痢疾志贺菌 ILPS的Ty21a中的表达。所得编码志贺菌LPS的质粒在非选择性培养基中预期稳定50个 以上的生长世代，但是其仍含有令人反感的抗生素抗性标记。缺失这个抗生素抗性标记导 致明显的质粒不稳定性。
[0012] 基于在世界范围内流行的特异性志贺菌属血清型及先前关于志贺菌属中血清型 交叉保护作用的研宄，Noriega, et al. (1999Infection and Immunity67:782-788)提出一 种含有宋内氏志贺菌、痢疾志贺菌1、弗氏志贺菌2a、弗氏志贺菌3a及弗氏志贺菌6的LPS 的多价疫苗可针对世界范围内~85%志贺菌病提供保护作用。
[0013] 活的、减毒的口服疫苗肠道沙门氏菌（Salmonella enterica)血清变型Typhi 菌株Ty21a已经广泛用作宽基口服疫苗载体以表达各种外来抗原（Xu et al. (2007) Vaccine,25:6167-6175 ；Xu et al. (2002)Infect. Immun. , 70:4414-4423 ；0sorio et al. (2009) Infect. Immun. , 44:1475-1482)。Ty21a是唯一得到许可的活的减毒的疫苗以针 对伤寒起保护作用。此外，其已经安全给予世界范围内超过2亿接受者。作为全细胞疫苗， Ty21a诱导粘膜、体液和细胞免疫性，导致针对伤寒的高水平长期的保护作用（即实际上 在 7 整年结束时未削弱的保护作用）（Levine, et al. (1999)Vaccine 17Suppl 2:S22-27)， 具有显著的针对副伤寒沙门氏菌（S. Paratyphi)A和B的交叉保护作用迹象（Bardhan, et al. (2010)Emerging Infec Diseases 16:1718-1723 ；D'Amelio et al. (1988)Infect. Immun. ,56:2731-2735 ；Levine, et al. (2007)Clin Infec Diseases 45Supp l:S24-28； Schwartz, et al. (1990)Archives Internal Medl50:349-351 ；ffahid, et al. (2012)Clin and Vaccine Immunol CVI 19:825-834)〇
[0014] 发明概述
[0015] 在较早的疫苗研宄中，转移编码宋内氏志贺菌的180kb I型0-抗原质粒，作为 原理论证，作为大的~300kb质粒的一部分共整合进疫苗菌株Ty21a。所得杂交疫苗菌 株5076-1C表达同源伤寒沙门氏菌9, 120-抗原和异源宋内氏志贺菌0-抗原，其均是 免疫原性的（Seid et al. (1984) J. Biol. Chem·，259:9028-9034 ;Formal et al. (1981) Infect. Immun.，34:746-750)。重要地，5076-1C 口服免疫志愿者是安全的并激发显 著的针对毒性宋内氏志贺菌口服攻击的保护作用（即针对严重痢疾的100 %保护作 用）（Black et al. (1987)J.Infect. Dis. ,155:1260-1265 ;Herrington et al. (1990) Vaccine，8:353-357 ;Van de Verg et al. (1990) Infect. Immun. ,58:2002-2004)。不幸 地，尽管不是完全意外地，在相当大的保护作用提供给接受前两批疫苗的志愿者中在随 后的疫苗批中未观测到，这是由于在5076-1C中遗传不稳定的大共整合质粒中丧失I型 基因区所致（Formal et al. (1981) Infect. Immun.，34:746-750)。因此，进行进一步的 分子学研宄以稳定疫苗载体构建体中宋内氏志贺菌1型基因区。在这些随后的研宄中， 确定为宋内氏志贺菌或痢疾志贺菌血清型10-抗原的稳定表达所需的最小大小的基因 区在 ll-15kb 之间（Xu et al. (2007) Vaccine, 25:6167-6175 ;Xu et al. (2002) Infect. Immun.，70:4414-4423)。这些研宄还表明宋内氏志贺菌0-抗原可以在Ty21a或者志贺菌 属中表达为核心-连接（core-linked)的LPS或者4型0-抗原荚膜，其是某些其它志贺菌 属血清型及伤寒沙门氏菌的LPS，但是任一型的0-抗原表达呈现出相等的免疫原性。
[0016] 这些早期的志贺菌属LPS构建体在低拷贝的遗传稳定的质粒PGB-2中产生，其携 带具有遗传用途的抗生素抗性标记。除去这个抗生素抗性标记以促进人疫苗使用结果是有 问题的，并导致无法解释的较低的质粒遗传稳定性（即抗生素抗性质粒在不存在抗生素压 力条件下生长期间可稳定超过60个世代，但是除去抗生素抗性基因序列则莫名地导致遗 传不稳定性）。
[0017] 因此，着手研宄以解决遗传稳定性的问题及需要可选择的但可除去的抗生素抗 性标记。为此，将先前描述的重组技术（03七86111?)6七31.(2000)?1'〇(3.似1：1.4〇3(1.3(3；[· USA，97:6640-6645)修改为将一个>1 Ikb的宋内氏志贺菌0-抗原生物合成基因区重组工程 化进伤寒沙门氏菌Ty2Ia染色体中以构建Ty2Ia-Ss (表达宋内氏志贺菌0-抗原的Ty2la)。 进一步地，这种基本的宋内氏志贺菌LPS生物合成基因的染色体整合是100 %遗传稳定 的，甚至在除去可选择的抗生素抗性基因盒之后也是稳定的。异源宋内氏志贺菌1型LPS 在Ty21a_Ss中与同源伤寒沙门氏菌0-抗原一起稳定表达。值得注意的是，候选疫苗菌株 Ty21a_Ss在小鼠中激发针对毒性宋内氏志贺菌攻击的有力免疫保护作用。
[0018] 一方面，本发明提供了伤寒沙门氏菌Ty21a，其包含插入伤寒沙门氏菌Ty2Ia染色 体中的宋内氏志贺菌0-抗原生物合成基因区，其中：a)异源宋内氏志贺菌1型0-抗原与 或不与同源伤寒沙门氏菌〇-抗原一起稳定表达；b)针对毒性宋内氏志贺菌攻击激发免疫 保护作用；及c)针对毒性伤寒沙门氏菌攻击激发免疫保护作用。另一方面，本发明提供了 伤寒沙门氏菌Ty21a，其包含插入伤寒沙门氏菌Ty21a染色体中的宋内氏志贺菌0-抗原生 物合成基因区，其中：a)异源宋内氏志贺菌1型0-抗原与同源伤寒沙门氏菌0-抗原一起 稳定表达；b)针对毒