组合物及使用方法
【专利说明】
[0001] 优先权
[0002] 本申请要求于2012年10月31日提交的美国临时申请序列号61/720, 732的优先 权，该临时申请据此全文以引用方式并入。
技术领域
[0003] 本发明组合物和方法涉及可从土曲霉（Aspergillus terreus)获得的β -葡糖苷 酶多肽、编码β-葡糖苷酶多肽的多核苷酸、以及其制备和使用方法。包含β-葡糖苷酶多 肽的制剂和组合物可用于降解或水解木素纤维素生物质。
【背景技术】
[0004] 纤维素和半纤维素是通过光合作用产生的最丰富的植物材料。它们可被多种 产生能够将聚合物底物水解成单体糖类的胞外酶的微生物（例如，细菌、酵母和真菌） 降解和用作能源（Aro et al·，（2001) J.Biol. Chem.，276:24309-24314(Aro 等人，2001 年，《生物化学杂志》，第276卷，第24309-24314页））。因为非可再生资源方法的局限 性，纤维素成为主要可再生能源的潜能是巨大的（Krishna et al.，（2001)Bioresource Tech.，77:193-196 (Krishna等人，2001年，《生物资源技术》，第77卷，第193-196页））。 通过生物过程对纤维素的有效利用是克服食品、饲料和燃料短缺的一种途径（Ohmiya et al.，（1997) Biotechnol. Gen. Engineer Rev.，14:365-414 (Ohmiya等人，1997 年，《生物技术 与遗传工程评论》，第14卷，第365-414页））。
[0005] 纤维素酶是水解纤维素（包含β-1，4-葡聚糖或β D-糖苷键）导致形成葡 萄糖、纤维二糖、纤维低聚糖等的酶。传统上将纤维素酶分为三大类：内切葡聚糖酶（EC 3.2. 1.4) ( "EG"）、外切葡聚糖酶或纤维二糖水解酶（EC3.2. 1.91) ( "CBH"）和β-葡 糖苷酶（[f3]-D-葡糖苷葡萄糖水解酶；EC3. 2.1.21)( "BG" MKnowles et al·，（1987) TIBTECH 5:255-261 (Knowles等人，1987年，《生物技术趋势》，第5卷，第255-261 页）；以及 Schulein，（1988)Methods Enzymol.，160:234_243(Schulein，1988 年，《酶 学方法》，第160卷，第234-243页））。内切葡聚糖酶主要作用在纤维素纤维的非晶 部分，而纤维二糖水解酶还能够降解结晶纤维素 （Nevalainen and Penttila, (1995) Mycota, 303-319 (Nevalainen 和 Penttila，1995 年，《菌界》，第 303-319 页））。因此，纤 维二糖水解酶在纤维素酶体系中的存在是结晶纤维素有效溶解所必需的（Suurnakki et al.，（2000) Cellulose, 7:189-209 (Suurnakki 等人，2000 年，《纤维素》，第 7 卷，第 189-209 页））。β -葡糖苷酶起到从纤维二糖、纤维低聚糖和其他葡糖苷释放D-葡萄糖单位的作用 (Freer, (1993) J. Biol. Chem.，268:9337-9342 (Freer，1993 年，《生物化学杂志》，第 268 卷， 第 9337-9342 页））。
[0006] 已知纤维素酶由大量细菌、酵母和真菌产生。某些真菌产生能够降解结晶形式 的纤维素的完全纤维素酶体系。这些真菌可经发酵而产生多组纤维素酶或纤维素酶混合 物。相同真菌和其他真菌也可被工程改造而产生或过量产生某些纤维素酶，从而得到包 含不同类型或比例的纤维素酶的纤维素酶混合物。真菌也可被工程改造使得它们经由 发酵而大量产生各种纤维素酶。丝状真菌发挥特别的作用，因为许多酵母例如酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)在其天然状态下缺乏水解纤维素的能力（参见例如，Wood et al·，（1988)Methods in Enzymology, 160:87-116 (Wood 等人，1988 年，《酶学方法》，第 160 卷，第 87-116 页））。
[0007] CBH、EG和BG的真菌纤维素酶分类可进一步扩展以包括每个分类内的多个组 分。例如，已从包括里氏木霉（Trichoderma reesei)(也称为红褐肉座菌（Hypocrea jecorina))的多个真菌来源分离了多种CBH、EG和BG，里氏木霉含有两种CBH的已知基因， 艮P，CBH I( "CBH1"）和 CBH II( "CBH2"），至少八种 EG 的已知基因，即，EG I、EG II、EG III、EGIV、EGV、EGVI、EGVII 和 EGVIII，以及至少五种 BG 的已知基因，即，BG1、BG2、BG3、BG4、 BG5 和 BG7 (Foreman et al. (2003)，J. Biol. Chem. 278 (34) : 31988-31997 (Foreman 等人， 2003年，《生物化学杂志》，第278卷，第34期，第31988-31997页））。EGIV、EGVI和EGVIII 也具有木葡聚糖酶活性。
[0008] 为了将结晶纤维素有效地转化成葡萄糖，需要包含来自CBH、EG和BG分类中每一 个的组分的完全纤维素酶体系，而分离的组分在水解结晶纤维素方面不太有效（Filho et al.，（1996) Can. J. Microbiol.，42:1-5 (Filho 等人，1996 年，《加拿大微生物学杂志》，第 42 卷，第1-5页））。内切-1，4-β -葡聚糖酶（EG)和外切纤维二糖水解酶（CBH)催化纤维素 水解为纤维低聚糖（纤维二糖作为主要产物），而葡糖苷酶（BGL)将低聚糖转化为葡萄 糖。已观察到来自不同分类的纤维素酶组分之间的协同关系。具体地讲，EG型纤维素酶和 CBH型纤维素酶协同地相互作用以有效地降解纤维素 。β -葡糖苷酶起到从纤维低聚糖诸 如纤维二糖释放葡萄糖的重要作用，纤维二糖对用于将糖发酵为乙醇的微生物诸如酵母具 有毒性；并且纤维二糖还抑制内切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶的活性，使得它们在进一步 水解结晶纤维素方面是低效的。
[0009] 鉴于β -葡糖苷酶在降解或转化纤维素材料方面所起到的重要作用，具有水解纤 维素给料的改善功效或能力的β-葡糖苷酶同源物的发现、表征、制备和应用是所需且有 利的。
【发明内容】
[0010] 可从土曲霍获得的β-葡糖苷酶及其用涂
[0011] 纤维素的酶法水解仍然是通过木素纤维素生物质给料来生物生产可为纤维素糖 和/或下游产物的材料的主要限制步骤之一。β -葡糖苷酶起到催化该过程最后一步，从抑 制性纤维二糖释放葡萄糖的重要作用，因此其活性和功效直接影响酶法木素纤维素生物质 转化的总体功效，并最终影响酶溶液的使用成本。因此，新型且更有效的β-葡糖苷酶的发 现、制备和使用受到广泛关注。
[0012] 虽然多种葡糖苷酶是已知的，包括来自里氏木霉或红褐肉座菌的葡 糖苷酶 Bgll、Bgl3、Bgl5、Bgl7 等（Korotkova O.G.et al·，（2009)Biochemistry 74:569-577 (Korotkova 0.G·等人，2009 年，《生物化学》，第 74 卷，第 569-577 页）； Chauve，M.et al.，（2010)Biotechnol.Biofuels 3:3_3(Chauve，M.等人，2010 年，《生 物燃料技术》，第3卷，第3-3页））、来自灰腐质霉高温变种（Humicola grisea var. thermoidea)的 β-葡糖苷酶（Nascimento，C.V.et al·，（2010)J. Microbiol. 48, 53-6 2(Nascimento，C.V.等人，2010年，《微生物学杂志》，第48卷，第53-62页；来自多粉 侧抱霉（Sporotrichum pulverulentum)的 β-葡糖苷酶（Deshpande V.et al·，（1988) Methods Enzymol.，160:415-424(Deshpande V.等人，1988 年，《酶学方法》，第 160 卷，第 415-424 页））；米曲霉（Aspergillus oryzae)的 β-葡糖苷酶（Fukuda T.et al·，（2007) Appl. Microbiol. Biotechnol. 76:1027-1033 (Fukuda Τ·等人，2007 年，《应用微生物学和 生物技术》，第76卷，第1027-1033页））；来自嗜热篮状菌（Talaromyces thermophilus) CBS 236. 58 的 β -葡糖苷酶（Nakkharat P. et al.，（2006) J. Biotechnol.，123:304-313 (Nakkharat P.等人，2006年，《生物技术杂志》，第123卷，第304-313页））、来自埃默森 篮状菌（Talaromyces emersonii)的 β-葡糖苷酶（Murray P.，et al·，（2004)Protein Expr.Purif. 38:248-257 (Murray P.等人，2004年，《蛋白质表达和纯化》，第38卷，第 248-257页），但迄今为止里氏木霉β-葡糖苷酶Bgll和黑曲霉（Aspergillus niger) β -葡糖苷酶SP188被认为是针对其来评价其他β -葡糖苷酶的活性和性能的基准β -葡 糖苷酶。据报道，里氏木霉Bgll具有比黑曲霉β-葡糖苷酶SP188更高的比活性，但前 者可能分泌极少，而后者对葡萄糖抑制更敏感（〇^11￥6，]\16〖31.，（2010)13；[0丨60111101· Biofuels, 3 (I) : 3 (Chauve，Μ.等人，2010年，《生物燃料技术》，第3卷，第1期，第3页））。
[0013] 本发明组合物和方法的一个方面是应用或使用分离自真菌物种土曲霉菌株 NIH2624的高度活性的β -葡糖苷酶来水解木素纤维素生物质底物。土曲霉菌株NIH2624 的基因组已在2005年注释，并且本文所述的SEQ ID NO: 2的序列由美国国家医学图书馆国 家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information, U. S. National Library of Medicine(NCBI))以登录号XP_001212225. I公布，并且认定为是β-葡糖 苷酶I前体。该酶此前已在转基因双子叶植物（例如，大豆植物）中进行表达以增强种 子产生多达种子干重5%的所需蛋白的能力。参见例如W02009158716。在这种情况下， 土曲霉的β-葡糖苷酶多肽被转基因植物作为蛋白贮藏的增强因子进行表达。又如，据 W02009108941中描述，土曲霉的β-葡糖苷酶多肽可在植物中表达，使得可将植物提取物 与细菌提取物组合以帮助植物释放可发酵糖。另一方面，土曲霉的β-葡糖苷酶此前未由 工程化微生物表达。其也未与一种或多种纤维素酶基因和/或一种或多种半纤维素酶基因 共表达。在合适