至少约125%，例如高至少约150% )。纤维二糖 水解测定法在本文的实例2C中有所描述。在一些实施例中，如使用纤维二糖水解测定法 (本文实例2C的测定法）所测量，本文的组合物和方法的Ate3C多肽的β -葡糖苷酶活性 为黑曲霉B-glu的约一半或更少、为约1/3或更少、为约1/4或更少。
[0024] 在一些实施例中，本文的组合物和方法的Ate3C多肽具有改善的纤维二糖水解活 性，但具有降低的水解氯-硝基-苯基-葡糖苷（CNPG)的能力。例如，本文的组合物和方 法的Ate3C多肽可具有与里氏木霉Bgll相比高至少20%的"纤维二糖酶"活性（即，测量 水解纤维二糖的能力），但具有低至少20%的水解CNPG的活性。在一些实施例中，本文的 组合物和方法的Ate3C多肽具有与黑曲霉B-glu相比更少（例如，约1/2或更少、约1/3或 更少、约1/4或更少）的纤维二糖酶活性，但具有增强的水解氯硝基-苯基-葡糖苷（CNPG) 的能力（例如，增强至少两倍、至少约3倍、至少约4倍）。
[0025] 在一些实施例中，如与里氏木霉Bgl 1相比，重组Ate3C多肽具有低约2倍、约3倍、 约4倍、或甚至约5倍的对于CNPG/纤维二糖的水解活性比率。在一些实施例中，如与黑 曲霉B-glu相比，Ate3C多肽具有高约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、或甚至约6倍的对于 CNPG/纤维二糖的相对水解活性比率。
[0026] 在某些方面，与野生型里氏木霉Bgll(序列为SEQ ID N0:4)相比，本发明的Ate3C 多肽和包含Ate3C多肽的组合物具有改善的水解木素纤维素生物质底物的性能。在一些实 施例中，与里氏木霉Bgll或包含里氏木霉Bgll的相同酶组合物从以相同方式预处理的相 同生物质在相同糖化条件下产生的葡萄糖的水平相比，能从以特定方式预处理的给定木素 纤维素生物质底物产生更大量的葡萄糖，由此可观察到Ate3C多肽或包含Ate3C多肽的组 合物的改善的水解性能。例如，当使用O-IOmg(例如，约lmg、约2mg、约3mg、约4mg、约5mg、 约6mg、约7mg、约8mg、约9mg、约IOmg)的β -葡糖苷酶（Ate3C多肽或里氏木霉Bgll)来 水解生物质底物中的Ig葡聚糖时，由Ate3C多肽或由包含Ate3C多肽的酶组合物所产生的 葡萄糖的量比由里氏木霉Bgll或包含里氏木霉Bgll (而非Ate3C多肽）的其他相同酶组 合物所产生的量大至少约5% (例如，至少约5%、至少约10%、至少约15%、至少约20%、 至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、或甚至至少约50% )。
[0027] 在一些方面，与里氏木霉Bgll或包含里氏木霉Bgll的其他相同酶组合物从以相 同方式预处理的相同生物质在相同糖化条件下产生的总糖的水平相比，能从以特定方式预 处理的给定木素纤维素生物质底物产生相等或减少量的总糖，由此可观察到Ate3C多肽或 包含Ate3C多肽的组合物的改善的水解性能。例如，当使用0.1 mg β -葡糖苷酶（Ate3C多 肽或里氏木霉Bgll)来水解生物质底物中的Ig葡聚糖时，由Ate3C多肽或包含Ate3C多肽 的酶组合物所产生的总糖的量与由里氏木霉Bgl 1或包含里氏木霉Bgl 1 (而非Ate3C多肽） 的其他相同酶组合物所产生的量相同，或者比之要少至少约5% (例如，至少约5%、至少约 10 %、至少约15 %、至少约20 %、至少约25 %、至少约30 %、至少约35 %、至少约40 %、至少 约45%、或甚至至少约50% )。
[0028] 在另外方面，与里氏木霉Bgll或包含里氏木霉Bgll的其他相同组合物从以相同 方式预处理的相同生物质在相同糖化条件下产生的葡萄糖的量和总糖的量相比，能通过水 解以特定方式预处理的给定木素纤维素生物质底物而产生增加量的葡萄糖及相等和减少 量的总糖，由此可观察到Ate3C多肽和包含Ate3C多肽的组合物的改善的水解性能。例如， 当使用 O-IOmg (例如，约 lmg、约 2mg、约 3mg、约 4mg、约 5mg、约 6mg、约 7mg、约 8mg、约 9mg、 约IOmg)的β -葡糖苷酶（Ate3C多肽或里氏木霉Bgl 1)来水解生物质底物PASC中的Ig葡 聚糖时，由Ate3C多肽或包含Ate3C多肽的组合物所产生的葡萄糖的量比由里氏木霉Bgll 或由包含里氏木霉Bgll的其他相同酶组合物产生的量大至少约5% (例如，至少约5%、至 少约10 %、至少约15 %、至少约20 %、至少约25 %、至少约30 %、至少约35 %、至少约40 %、 至少约45%、或甚至至少约50% )，而由Ate3C多肽或包含Ate3C多肽的组合物所产生的 总糖的量与由里氏木霉Bgll或由包含里氏木霉Bgll的其他相同酶组合物所产生的量相 同，或者比之要少约5% (例如，至少约5%、至少约10%、至少约15%、至少约20%、至少约 25%、至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、或甚至至少约50% )。
[0029] 本发明组合物和方法的各方面包括包含如上文详述的重组Ate3C多肽和木素纤 维素生物质的组合物。合适的木素纤维素生物质可例如来源于农作物、食物或饲料生产 的副产物、木素纤维素废品、植物残体（包括例如草渣）或废纸或纸制废品。在某些实 施例中，已对木素纤维素生物质进行一个或多个预处理步骤以使木聚糖、半纤维素、纤维 素和/或木质素材料更易被酶触及或对酶更敏感，从而更适合酶法水解。合适的预处理 方法可为例如在反应器中对生物质材料使用包含强酸和金属盐的稀溶液的催化剂。参 见例如美国专利No. 6, 660, 506、No. 6, 423, 145。作为另一种选择，合适的预处理可为 例如如美国专利No. 5, 536, 325中所述的多步骤方法。在某些实施例中，根据美国专利 No. 6, 409, 841的公开内容，可使用约0.4 %至约2 %的强酸对生物质材料进行一个或多 个阶段的稀酸水解。预处理方法的另外实施例可包括如下文献中所述的那些：例如，美 国专利 No. 5, 705, 369 ;Gould, (1984) Biotech. &Bioengr.，26:46-52 (Gould，1984 年，《生 物技术与生物工程》，第 26 卷，第 46-52 页）；Teixeira et al.，（1999)Appl.Biochem & Biotech.，77-79:19-34 (Teixeira等人，1999年，《应用生物化学与生物技术》，第77-79卷， 第19-34页）；国际公布的专利申请W02004/081185 ;或美国专利公布No. 20070031918或国 际公布的专利申请W006110901。
[0030] 本发明还涉及编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽的分离的多核苷酸，其中所述分 离的多核苷酸选自：
[0031] (1)编码包含与SEQ ID NO: 2或与SEQ ID NO: 3具有至少85% (例如，至少85%、 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)同一性的氨基酸序列 的多肽的多核苷酸；
[0032] (2)与 SEQ ID N0:1 具有至少 85% (例如，至少 85%、90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、99%或100%)同一性的多核苷酸，或者在中等严格条件、高度严格 条件或极高严格条件下杂交于SEQ ID NO: 1或杂交于其互补序列。
[0033] 本发明组合物和方法的各方面包括采用编码包含与SEQ ID NO: 2的氨基酸序列或 成熟序列SEQ ID N0:3的氨基酸序列具有至少85%同一性（例如，至少85%、90%、91%、 92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)的氨基酸序列的重组多肽的分离 的核酸序列，来制备或产生具有β-葡糖苷酶活性的Ate3C多肽的方法。在一些实施例中， 所述多肽还包含天然或非天然的信号肽，使得所产生的Ate3C多肽被宿主生物体分泌，例 如，信号肽包含与SEQ ID NO: 13 (里氏木霉Bgll的信号序列）具有至少90%同一性的序列。 在某些实施例中，分离的核酸包含与SEQ ID NO: 1具有至少85% (例如，至少85%、90%、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)同一性的序列。在某些实施 例中，分离的核酸还包含编码信号肽序列的核酸序列。在某些实施例中，信号肽序列可为选 自SEQ ID NO: 13-42的一者。在某些具体实施例中，编码SEQ ID NO: 13的信号肽序列的核 酸序列用于在里氏木霉中表达Ate3C多肽。
[0034] 本发明组合物和方法的各方面包括包含与调控序列有效组合的上述分离的核酸 的表达载体。
[0035] 本发明组合物和方法的各方面包括包含表达载体的宿主细胞。在某些实施例中， 宿主细胞为细菌细胞或真菌细胞。在某些实施例中，包含表达载体的宿主细胞为能够代谢 由木素纤维素生物质的水解所产生的可溶性糖的产乙醇微生物，其中所述水解是化学和/ 或酶促过程的结果。
[0036] 本发明组合物和方法的各方面包括包含上述宿主细胞和培养基的组合物。本发明 组合物和方法的各方面包括产生Ate3C多肽的方法，该方法包括：将上述宿主细胞在合适 的条件下培养于培养基中以产生β-葡糖苷酶。
[0037] 本发明组合物和方法的各方面包括包含根据上述用于产生葡糖苷酶的方法 所产生的培养基上清液中的Ate3C多肽的组合物。
[0038] 在一些方面，本发明涉及包含编码如上文和本文所述的具有β -葡糖苷酶活性的 多肽的多核苷酸的核酸构建体、重组表达载体、工程化宿主细胞。在另外方面，本发明涉及 使用核酸构建体、重组表达载体和/或工程化宿主细胞来制备或产生本发明的β -葡糖苷 酶多肽或包含此类葡糖苷酶多肽的组合物的方法。具体地讲，本发明涉及例如包含有 效连接至β -葡糖苷酶的成熟序列的合适信号肽的核酸构建体、分离的多核苷酸、核酸构 建体、重组表达载体或包含此类核酸构建体的工程化宿主细胞，所述β-葡糖苷酶的成熟 序列与SEQ ID NO: 2或与SEQ ID NO: 3的成熟序列具有至少85%同一性，或者由与SEQ ID NO:1具有至少85 %同一性的多核苷酸编码。在一些实施例中，信号肽和β-葡糖苷酶序列 来源于不同微生物。
[0039] 还提供了包含与调控序列有效组合的分离的核酸的表达载体。另外，提供了包含 该表达载体的宿主细胞。在另外的实施例中，提供了组合物，该组合物包含宿主细胞和培养 基。
[0040] 在一些实施例中，宿主细胞为细菌细胞或真菌细胞。在某些实施例中，宿主细胞 为产乙醇微生物，该产乙醇微生物能够代谢通过水解木素纤维素生物质底物而产生的可 溶性糖，其中所述水解可通过化学水解或酶法水解或这些方法的组合来进行，但所述产乙 醇微生物也能够表达异源酶。在一些实施例中，宿主细胞为酿酒酵母或运动发酵单胞菌 (Zymomonas mobilis)细胞，它们不仅能够表达异源多肽诸如本发明的Ate3C多肽，而且能 够将糖发酵成乙醇和/或下游产物。在某些具体实施例中，表达β-葡糖苷酶的酿酒酵母 细胞