或运动发酵单胞菌细胞能够对由包含一种或多种β-葡糖苷酶的酶组合物从木素纤 维素生物质产生的糖进行发酵。所述包含一种或多种β-葡糖苷酶的酶组合物可包含相同 的β-葡糖苷酶或可包含一种或多种不同的β-葡糖苷酶。在某些实施例中，所述包含一种 或多种β-葡糖苷酶的酶组合物可为由工程化宿主细胞产生的酶混合物，该工程化宿主细 胞可为细菌或真菌细胞。当酿酒酵母或运动发酵单胞菌细胞表达本公开的Ate3C多肽时， Ate3C多肽可被表达但不被分泌。因此，必须将纤维二糖引入或"转运"到此类宿主细胞中， 以便β-葡糖苷酶Ate3C多肽催化D-葡萄糖的释放。因此，在某些实施例中，除编码Ate3C 多肽的基因外，还用纤维二糖转运体基因转化酿酒酵母或运动发酵单胞菌细胞。已将纤维 二糖转运体和β -葡糖苷酶在酿酒酵母中表达，使得所得微生物能够发酵纤维二糖，例如 Ha et al·，（2011)PNAS，108(2) :504-509 (Ha 等人，2011 年，《美国国家科学院院刊》，第 108 卷，第2期，第504-509页）中所述。已将另一种纤维二糖转运体在毕赤酵母（Pichia)中 表达，例如公布的美国专利申请No. 20110262983中所述。已将纤维二糖转运体引入大肠杆 菌（E.coli)中，例如 Sekar et al·，（2012)Applied Environmental Microbiology, 78(5) :1611-1614 (Sekar等人，2012年，《应用与环境微生物学》，第78卷，第5期，第1611-1614 页）中所述。
[0041] 在另外的实施例中，Ate3C多肽由宿主细胞异源表达。例如，Ate3C多肽由并非土 曲霉的工程化微生物表达。在一些实施例中，Ate3C多肽与一种或多种不同的纤维素酶基 因共表达。在一些实施例中，Ate3C多肽与一种或多种半纤维素酶基因共表达。
[0042] 在一些方面，提供了包含前面段落所述的重组Ate3C多肽的组合物以及制备此类 组合物的方法。在一些实施例中，该组合物还包含一种或多种其他纤维素酶，其中所述一种 或多种其他纤维素酶由宿主细胞连同Ate3C多肽一起共表达。例如，所述一种或多种其他 纤维素酶可选自无或一种或多种其他β -葡糖苷酶、一种或多种纤维二糖水解酶和/或一 种或多种内切葡聚糖酶。此类其他β-葡糖苷酶、纤维二糖水解酶和/或内切葡聚糖酶（如 果存在的话）可由单个宿主细胞连同Ate3C多肽一起共表达。所述两种或更多种纤维素酶 中的至少两种可彼此异源或者来源于不同生物体。例如，该组合物可包含两种β-葡糖苷 酶，其中第一种为Ate3C多肽，并且第二β-葡糖苷酶不来源于土曲霉菌株。例如，该组合 物可包含并非来源于土曲霉的至少一种纤维二糖水解酶、一种内切葡聚糖酶或一种β -葡 糖苷酶。在一些实施例中，纤维素酶中的一种或多种是宿主细胞内源性的，但被过表达或以 与天然存在于宿主细胞中的水平不同的水平表达。例如，纤维素酶中的一种或多种可为里 氏木霉宿主细胞天然存在的里氏木霉CBHl和/或CBH2,但当它们在里氏木霉宿主细胞中连 同Ate3C多肽一起共表达时，CBHl和CBH2中任一者或两者被过表达或低表达。
[0043] 在某些实施例中，包含重组Ate3C多肽的组合物还可包含一种或多种半纤维素 酶，其中所述一种或多种半纤维素酶由宿主细胞连同Ate3C多肽一起共表达。例如，所述一 种或多种半纤维素酶可选自一种或多种木聚糖酶、一种或多种β-木糖苷酶和/或一种或 多种L-阿拉伯呋喃糖苷酶。此类其他木聚糖酶、β -木糖苷酶和L-阿拉伯呋喃糖苷酶（如 果存在的话）可由单个宿主细胞连同Ate3C多肽一起共表达。在一些实施例中，该组合物 可包含并非来源于土曲霉的至少一种β -木糖苷酶、木聚糖酶或阿拉伯呋喃糖苷酶。
[0044] 在另外方面，包含重组Ate3C多肽的组合物还可包含一种或多种其他纤维素酶和 一种或多种半纤维素酶，其中所述一种或多种纤维素酶和/或一种或多种半纤维素酶由宿 主细胞连同Ate3C多肽一起共表达。例如，除与其他非纤维素酶、非半纤维素酶的酶或蛋 白一起之外，Ate3C多肽还可连同一种或多种其他β -葡糖苷酶、一种或多种纤维二糖水 解酶、一种或多种内切葡聚糖酶、一种或多种内切木聚糖酶、一种或多种β -木糖苷酶和一 种或多种L-阿拉伯呋喃糖苷酶一起在相同宿主细胞中共表达。本发明组合物和方法的各 方面因此包括包含上述除Ate3C多肽之外还共表达多种酶的宿主细胞以及培养基的组合 物。本发明组合物和方法的各方面因此包括产生含Ate3C的酶组合物的方法，该方法包括： 将共表达上述多种酶与Ate3C多肽的宿主细胞在合适的条件下培养于培养基中，以产生 Ate3C和其他酶。还提供了组合物，该组合物包含根据本文方法产生于培养基上清液中的 Ate3C多肽和其他酶。此类培养基上清液可按原样使用，进行很少或不进行产生后的加工， 所述产生后的加工可通常包括用以移除细胞碎片的过滤、细胞杀死程序和/或用以富集或 浓缩其中的酶的超滤或其他步骤。此类上清液在本文中称为"全发酵液"或"全纤维素酶发 酵液"。
[0045] 在另外方面，本发明涉及在适于降解或转化纤维素材料并适于从纤维素材料产生 物质的条件下施加或使用上述组合物的方法。
[0046] 在另一个方面，提供了用于将纤维素材料降解或转化成可发酵糖的方法，该方 法包括：使优选地已进行一个或多个预处理步骤的纤维素材料与前面段落之一中所述的 Ate3C多肽或包含此类多肽的组合物接触，以得到可发酵糖。
[0047] 因此，本说明书涉及下列具体方面：
[0048] 在第一方面，一种重组多肽，该重组多肽包含与SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3的氨 基酸序列具有至少85%同一性的氨基酸序列，其中该多肽具有β -葡糖苷酶活性。
[0049] 在第二方面，根据第一方面所述的重组多肽，其中当重组多肽和里氏木霉Bgll用 于水解木素纤维素生物质底物时，与里氏木霉Bgll相比，该多肽具有改善的β-葡糖苷酶 活性。
[0050] 在第三方面，根据第一方面或第二方面所述的重组多肽，其中所述改善的葡 糖苷酶活性为增强的纤维二糖酶活性或改善的水解纤维二糖的能力，从而释放D-葡萄糖。
[0051] 在第四方面，根据第一方面至第三方面中任一方面所述的重组多肽，其中所述改 善的葡糖苷酶活性是在相同的糖化条件下，从木素纤维素生物质获得增加的葡萄糖收 率以及相等或更低的总糖收率。
[0052] 在第五方面，根据上文中第一方面至第四方面中任一方面所述的重组多肽，其中 木素纤维素生物质为已在糖化之前进行预处理的木素纤维素生物质。所述预处理可适当地 为本领域中已知的使木素纤维素生物质底物更易于被酶触及和水解的那些，其可包括例如 本文所述的那些预处理方法。
[0053] 在第六方面，根据上文中第一方面至第五方面中任一方面所述的重组多肽，其中 该多肽包含与SEQ ID Ν0:2或SEQ ID Ν0:3的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序 列。
[0054] 在第七方面，根据上文中第一方面至第五方面中任一方面所述的重组多肽，其中 该多肽包含与SEQ ID Ν0:2或SEQ ID Ν0:3的氨基酸序列具有至少95%同一性的氨基酸序 列。
[0055] 在第八方面，一种组合物，该组合物包含根据上文中第一方面至第七方面中任一 方面所述的重组多肽，还包含一种或多种其他纤维素酶。
[0056] 在第九方面，根据第八方面所述的组合物，其中所述一种或多种其他纤维素酶选 自无或一种或多种其他β -葡糖苷酶、一种或多种纤维二糖水解酶和一种或多种内切葡聚 糖酶。
[0057] 在第十方面，一种组合物，该组合物包含根据上文中第一方面至第七方面中任一 方面所述的重组多肽，还包含一种或多种半纤维素酶。
[0058] 在第十一方面，根据如上第八方面或第九方面所述的组合物，还包含一种或多种 半纤维素酶。
[0059] 在第十二方面，根据如上第十方面或第十一方面所述的组合物，其中所述一种或 多种半纤维素酶选自一种或多种木聚糖酶、一种或多种β-木糖苷酶和一种或多种L-阿拉 伯呋喃糖苷酶。
[0060] 在第十三方面，一种核酸，该核酸编码根据第一方面至第七方面中任一方面所述 的重组多肽。
[0061] 在第十四方面，根据第十三方面所述的核酸，还包含信号序列。
[0062] 在第十五方面，根据第十四方面所述的核酸，其中信号序列选自SEQ ID NO:13-42。
[0063] 在第十六方面，一种表达载体，该表达载体包含与调控序列有效组合的根据第 十三方面至第十五方面中任一方面所述的核酸。
[0064] 在第十七方面，一种宿主细胞，该宿主细胞包含根据第十六方面所述的表达载体。
[0065] 在第十八方面，根据第十七方面所述的宿主细胞，其中该宿主细胞为细菌细胞或 真菌细胞。多种细菌细胞已知是如本文所述的合适的宿主细胞。多种真菌细胞也是合适的。 在一些实施例中，细菌或真菌宿主细胞可为这样的宿主细胞，其为能够将某些单体糖发酵 或代谢成乙醇的产乙醇生物。例如，细菌产乙醇运动发酵单胞菌可为表达本公开的β-葡 糖苷酶多肽的宿主细胞。例如，真菌产乙醇酿酒酵母也可用作宿主细胞以产生本公开的 葡糖苷酶多肽。
[0066] 在第十九方面，一种组合物，该组合物包含根据第十六方面或第十七方面所述的 宿主细胞和培养基。
[0067] 在第二十方面，一种产生β -葡糖苷酶的方法，该方法包括将根据第十七方面或 第十八方面所述的宿主细胞在合适条件下培养于培养基中，以产生β-葡糖苷酶。
[0068] 在第21方面，一种组合物，该组合物包含根据上文中第20方面所述的方法产生于 培养基上清液中的β-葡糖苷酶。
[0069] 在第22方面，一种用于水解木素纤维素生物质底物的方法，该方法包括使木素纤 维素生物质底物与根据第一方面至第七方面中任一方面所述的多肽或与根据第21方面所 述的组合物接触，以得到葡萄糖和/或其他糖。
[0070] 根据如下描述，Ate3C组合物和方法的这些及其他方面将显而易见。
【附图说明】
[0071] 图 1 描绘了 pENTR/D-TOPO-Bgll (943/942)载体的图谱。
[0072] 图2描绘了 pTrex3g 943/942构建体的图谱。
[0073] 图3A-图3C提供了使用磷酸溶胀纤维素酶（PASC)作为底物，在50°C下持续I. 5h 时Ate3C与基准里氏木霉Bgll的水解性能的比较，其中将Ate3C和Bgll加入由根据公布 的专利申请WO 2011/038019中所述的工程化里氏木霉菌株产生的背景全纤维素酶中，并 且将β -葡糖苷酶+全纤维素酶混合物以各种β -葡糖苷酶剂量与PASC底物混合。图3A 描绘了各种葡糖苷酶剂量下的葡聚糖转化率的测量和比较。图3Β描绘了各种β-葡 糖苷酶剂量下的总葡萄糖产量的测量和比较。图3C描绘了通过以各种β-葡糖苷酶剂量 水解PASC所产生的纤维二糖的测量和比较。
[0074] 图4Α-图4Β提供了使用稀氨水预处理的玉米秸杆（DACS)作为底物，在50°C下持 续2天时Ate3C与基准里氏木霉