Bgll的水解性能的比较，其中将Ate3C和Bgll加入由根 据公布的专利申请WO 2011/038019中所述的工程化里氏木霉菌株产生的背景全纤维素酶 中，并且将β -葡糖苷酶+纤维素酶混合物以各种总蛋白比纤维素剂量与DACS底物混合。 图4Α描绘了各种总蛋白比纤维素剂量下的总葡聚糖转化率的测量和比较。图4Β描绘了各 种总蛋白比纤维素剂量下的总葡萄糖产量的测量和比较。
[0075] 图5Α-图5Β提供了使用稀氨水预处理的玉米秸杆（DACS)作为底物，在50°C下持 续2天时Ate3C与基准里氏木霉Bgl 1的水解性能的比较，其中将各种剂量的Ate3C和Bgl 1 加入全纤维素酶中，该全纤维素酶以恒定的13. 4mg蛋白/g纤维素使用，由根据公布的专利 申请WO 2011/038019中所述的工程化里氏木霉菌株产生。图5A描绘了在各种β-葡糖苷 酶加载量（其中全纤维素酶背景保持为恒定的13. 4mg蛋白/g纤维素）下的总葡聚糖转化 率的测量和比较。图5B描绘了在各种β-葡糖苷酶加载量（其中全纤维素酶背景保持为 恒定的13. 4mg蛋白/g纤维素）下的总葡萄糖产量的测量和比较。
[0076] 图6描绘了酵母穿梭载体pSCll构建体，其包含经优化和合成以在酿酒酵母产乙 醇生物中表达Ate3C多肽的Ate3C基因。
[0077] 图7描绘了运动发酵单胞菌整合载体pZCl 1，其包含经优化和合成以在运动发酵 单胞菌产乙醇生物中表达Ate3C多肽的Ate3C基因。
[0078] 图8A-图8D描绘了本公开的序列和序列标识符。
【具体实施方式】 [0079] I.综沭
[0080] 本文描述了涉及重组β_葡糖苷酶Ate3C的组合物和方法，该重组β-葡糖苷酶 Ate3C属于来自土曲霉的糖基水解酶家族3。本发明组合物和方法部分地基于这样的观察： 当组合物用于水解木素纤维素生物质材料或给料时，与例如已知的里氏木霉的基准高保真 性β -葡糖苷酶Bgl 1相比，重组Ate3C多肽具有更高纤维素酶活性并且作为酶组合物的组 分更加稳健。Ate3C多肽的这些特征使它们或其变体适用于许多过程，包括例如适用于木素 纤维素生物质给料的转化或水解。
[0081] 在更详细地描述本发明组合物和方法之前，应当理解，本发明组合物和方法不限 于所述的具体实施例，因为这些当然可改变。还应当理解，本文所用的术语仅出于描述具体 的实施例的目的，并非旨在进行限制，因为本发明组合物和方法的范围将仅受所附权利要 求的限定。
[0082] 当提供值的范围时，应当理解，介于该范围的上限与下限之间的每一个中间值 (除非上下文另有明确指明，否则精确到下限单位的十分之一）和所述范围内的任何其他 所述值或中间值均涵盖于本发明的组合物和方法内。这些较小范围的上限和下限可以独立 地被包括在较小的范围内，并且也涵盖于本发明组合物和方法内，除非是在所述范围内的 任何明确排除的界限。当所述范围包括界限中的一者或两者时，排除这些被包括的界限中 的任一者或两者的范围，也被包括在本发明组合物和方法中。
[0083] 某些范围在本文中通过前面带有术语"约"的数值表述。术语"约"在本文中用于 为它之后的确切数字以及接近或近似该术语之后的数字的数字提供字面支持。在确定数字 是否接近或近似明确列举的数字时，接近或近似的未列举的数字可以是在其中表述它的上 下文中提供明确列举的数字的基本上等值的数字。例如，与数值相关的术语"约"是指该数 值的-10%至+10%的范围，除非该术语在上下文中另有明确定义。又如，短语"约6的pH 值"是指5. 4至6. 6的pH值，除非pH值另有明确定义。
[0084] 本文提供的标题并不是对本发明组合物和方法的各个方面或实施例的限制，这些 方面或实施例都可以通过整体参考本说明书而获得。因此，通过整体参考本说明书可更完 全地限定下文定义的术语。
[0085] 本文档被组织成多个章节，以便于阅读；然而，读者将会认识到，在一个章节中进 行的陈述可以应用到其他章节。因此，本公开不同章节使用的标题不应理解为限制性的。 [0086] 除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明组合物和方 法所属领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。尽管与本文所述的那些相似或等同的 任何方法和材料也可用于实践或测试本发明组合物和方法，但是现在描述的是代表性的示 例性方法和材料。
[0087] 在本说明书中引用的所有出版物和专利以引用的方式并入本文，如同每个单独的 出版物或专利明确地并单独地指示为以引用的方式并入，并且以引用方式并入本文来公开 和描述与引用出版物有关的方法和/或材料。任何出版物的引用是关于提交日前的其公开 内容，并不应视为承认本发明组合物和方法由于在先发明而无权早于此类出版物。另外，所 提供的公布日期可能与实际的公布日期不同，这可能需要独立地核实。
[0088] 根据此详细描述，应用下面的缩写和定义。注意，除非上下文另有明确指明，否则 单数形式"一个"、"一种"和"所述（该）"包括多个指代物。因此，例如，提及"酶"包括多个 此类酶，而提及"剂量"则包括提及一个或多个剂量以及本领域技术人员已知的其等同物， 等等。
[0089] 还应当注意，权利要求书可能撰写成排除了任何任选元素。由此，该陈述旨在充当 使用与权利要求书要素的引用相关的诸如"仅有"、"只有"等等的排他性术语或使用"负性" 限制的先彳T基础。
[0090] 当关于对象细胞、核酸、多肽/酶或载体而使用时，术语"重组"指该对象已从其天 然状态经过修饰。因此，例如，重组细胞表达未在天然（非重组）形式的细胞中存在的基因， 或者以不同于自然界中存在的水平或条件表达天然基因。重组核酸可与天然序列相差一个 或多个核苷酸和/或在表达载体中有效连接至异源序列，例如异源启动子、允许分泌的信 号序列等。重组多肽/酶可与天然序列相差一个或多个氨基酸和/或与异源序列融合。包 含编码β-葡糖苷酶的核酸的载体为例如重组载体。
[0091] 还应当注意，如本文所用，术语"基本上由…组成"是指这样的组成，其中该术语之 后的组分与其他已知的组分共存，所述其他已知的组分总量少于总组成的30重量％，并且 不会促进或干扰组分的作用或活性。
[0092] 还应当注意，如本文所用，术语"包含"意指包括但不限于术语"包含"之后的组分。 术语"包含"之后的组分是必要或强制性的，但包含该组分的组合物还可包含其他非强制性 或任选的组分。
[0093] 还应当注意，如本文所用，术语"由…组成"意指包括并限于术语"由…组成"之后 的组分。因此术语"由…组成"之后的组分是必要或强制性的，并且组合物中不存在其他组 分。
[0094] 对于本领域技术人员而言，阅读本公开后将显而易见的是，本文所描述和图示的 各个实施例中的每一个都具有分立的组分和特征，在不脱离本文所述的本发明组合物和方 法的范围或实质的前提下，这些组分和特征可容易地与其他若干实施例中任一者的特征分 离或合并。任何所列举的方法可以按列举的事件顺序或按逻辑上可行的任何其他顺序实 施。
[0095] II.宙义
[0096] " β -葡糖苷酶"是指Ε. C. 3. 2. 1. 21的β -D-葡糖苷葡萄糖水解酶。因此，术语 " β -葡糖苷酶活性"是指催化β -D-葡萄糖或纤维二糖的水解以释放D-葡萄糖的能力。 β -葡糖苷酶活性可使用例如纤维二糖酶测定法确定，该纤维二糖酶测定法测量酶催化纤 维二糖底物的水解以得到D-葡萄糖的能力，如本公开的实例2C中所述。
[0097] 如本文所用，"Ate3C"或"Ate3C多肽"是指属于来源于土曲霉的糖基水解酶家族3 的β -葡糖苷酶（例如，重组β -葡糖苷酶）（和其变体），与基准β -葡糖苷酶，即具有SEQ ID Ν0:4的氨基酸序列的野生型里氏木霉Bgll多肽相比时，其具有改善的水解木素纤维素 生物质底物的性能。根据本发明组合物和方法的各方面，Ate3C多肽包括具有SEQ ID NO: 2 所示的氨基酸序列的那些多肽，以及与SEQ ID N0:2的氨基酸序列、或与成熟序列SEQ ID NO:2、或与SEQ ID NO:2的至少100个残基长的片段具有至少85%、至少90%、至少91%、 至少92 %、至少93 %、至少94%、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %或至少99 %序 列同一性的衍生物或变体多肽，其中Ate3C多肽不仅具有β -葡糖苷酶活性并能够催化纤 维二糖转化成D-葡萄糖，而且与里氏木霉Bgl 1相比，具有更高的β -葡糖苷酶活性并具有 更高的催化纤维二糖转化成D-葡萄糖的能力。
[0098] 要用于本公开的组合物和方法中的Ate3C多肽将具有SEQ ID NO: 2的氨基酸序列 的多肽、或由SEQ ID N0:2的第20至861位残基组成的多肽、或成熟序列SEQ ID N0:3的 至少10%、优选至少20%、更优选至少30%、并且甚至更优选至少40%、更优选至少50%、 甚至更优选至少60 %、并且优选至少70 %、更优选至少90 %、甚至更优选至少100 %或更多 的β-葡糖苷酶活性。
[0099] "家族3糖基水解酶"或"GH3"是指符合根据如下文献的分类的糖基水解酶 家族 3 的定义的多肽：Henrissat, Biochem. J. 280:309-316 (1991) (Henrissat，《生物 化学杂志》，第 280 卷，第 309-316 页，1991 年）和 Henrissat & Cairoch, Biochem. J.，316:695-696 (1996) (Henrissat 和 Cairoch，《生物化学杂志》，第 316 卷，第 695-696 页， 1996 年）。
[0100] 可分离或纯化根据本文所述的本发明组合物和方法的Ate3C多肽。所谓纯化或 分离意指通过将Ate3C从与其天然相关的天然存在的成分中的一些或所有分离而使Ate3C 多肽从其天然状态改变。此类分离或纯化可通过本领域公认的分离技术诸如离子交换色谱 法、亲和色谱法、疏水分离、渗析、蛋白酶处理、硫酸铵沉淀法或其他蛋白质盐沉淀法、离心、 尺寸排阻色谱法、过滤、微量过滤、凝胶电泳或梯度分离来实现，以移除最终组合物中不期 望的全细胞、细胞碎片、杂质、外来蛋白质或酶。进一步可能的是，然后将能提供另外益处的 多种成分加入含Ate3C的组合物中，例如，活化剂、抗抑制剂、所需离子、控制pH的化合物、 或者其他酶或化学品。
[0101] 如本文所用，"微生物"是指细菌、真菌、病毒、原生动物、以及其他微生物或微观生 物体。
[0102] 如本文所用，多肽的"衍生物"或"变体"意指通过如下方式衍生自前体多肽（例 如，天然多肽）的多肽：将一个或多个氨基酸添加到C端和N端中任一者或两者上，在氨基 酸序列中的一个或多个不同位点置换一个或多个氨基酸，在多肽的任一个或两个末端或在 氨基酸序列的一个或多个位点缺失一个或多个氨基酸，或者在氨基酸序列的一个或多个位 点插入一个或多个氨基酸。Ate3C衍生物或变体的制备可以任何方便的方式实现，例如通过 修饰编码天然多肽的DNA序列、将该DNA序列转化到合适的宿主中、以及表达经修饰的DNA 序列以形成衍生物/变体A