te3C。衍生物或变体还包括经化学修饰例如糖基化或以其他方 式改变Ate3C多肽的特性的Ate3C多肽。虽然Ate3C的各种衍生物和变体被本发明组合物 和方法所涵盖，但与在相同木素纤维素生物质底物水解条件下的SEQ ID N0:4的野生型里 氏木霉Bgll相比时，此类衍生物和变体将表现出改善的β -葡糖苷酶活性。
[0103] 在某些方面，本文组合物和方法的Ate3C多肽还可涵盖多肽的功能片段或具有 β-葡糖苷酶活性的多肽片段，其衍生自亲本多肽，所述亲本多肽可为包含SEQ ID N0:2或 由SEQ ID NO: 2组成的全长多肽、或包含SEQ ID NO: 3或由SEQ ID NO: 3组成的成熟序列。 功能多肽可在N端区域或C端区域的任一者中或在这两个区域中被截短而生成亲本多肽 的片段。出于本公开的目的，功能片段必须具有亲本多肽的至少20%、更优选至少30%、 40 %、50 %或优选至少60 %、70 %、80 %、或甚至更优选至少90 %的β -葡糖苷酶活性。
[0104] 在某些方面，Ate3C衍生物/变体将与SEQ ID NO: 2的氨基酸序列或与成熟序列 SEQ ID N0:3具有85%至99% (或更大）氨基酸序列同一性的任何值，例如，与SEQ ID N0:2 的氨基酸序列或与成熟序列SEQ ID N0:3具有85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、 92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%氨基酸序列同一性。在一些实施例中，氨基 酸置换为使用L-氨基酸的"保守氨基酸置换"，其中一个氨基酸被另一个生物学上类似的 氨基酸替换。保守氨基酸置换是保留被置换的氨基酸的总体电荷、疏水性/亲水性和/或空 间位阻的那些置换。保守置换的例子是下列各组之间的那些置换：Gly/Ala、Val/Ile/Le U、 Lys/Arg、Asn/Gln、Glu/Asp、Ser/Cys/Thr 和 Phe/Trp/Tyr。衍生物可例如相差少至 1 至 10 个氨基酸残基，诸如6-10个、少至5个、少至4个、3个、2个、或甚至1个氨基酸残基。在一 些实施例中，Ate3C衍生物可具有N端和/或C端缺失，其中不包含缺失末端部分的Ate3C 衍生物与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3中的连续子区域相同。
[0105] 如本文所用，相对于本文鉴定的氨基酸或核苷酸序列的"序列同一性百分比 (%) "被定义为在对序列进行比对并根据需要引入空位以实现最大序列同一性百分比并且 不将任何保守置换视为序列同一性的一部分之后，与Ate3C序列中的氨基酸残基或核苷酸 相同的候选序列中的氨基酸残基或核苷酸的百分比。
[0106] 所谓"同源物"应当意指与所讨论的氨基酸序列和所讨论的核苷酸序列具有指定 程度的同一性的实体。同源序列被认为包括与所讨论的序列具有至少75%、80%、85%、 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或甚至99%同 一性的氨基酸序列，该同一性使用常规的序列比对工具（例如，Clustal、BLAST等等）测量。 通常，除非另外指明，否则同源物将包括与所讨论的氨基酸序列相同的活性位点残基。
[0107] 用于执行序列比对和确定序列同一性的方法是技术人员已知的，可在不进行过 多实验的情况下执行，并且可确切获得同一性值的计算。参见例如Ausubel et al.，eds. (1995)Current Protocols in Molecular Biology, Chapterl9 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York) (Ausubel等人编辑，1995年，《分子生物学现行规范》， 第19章，格林出版与威立国际科学，纽约）；以及ALIGN程序（Dayhoff (1978) in Atlas of Protein Sequence and Structure 5:Suppl.3 (National Biomedical Research Foundation, Washington, D. C.) (Dayhoff，1978年，《蛋白质序列和结构图册》，第5卷，增 刊3,国家生物医学研宄基金会，华盛顿特区））。多种算法可用于对序列进行比对并确定序 列同一性，并且包括例如，Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol. 48:443 (Needleman 等人， 1970年，《分子生物学杂志》，第48卷，第443页）的同源性比对算法；Smith et al. (1981) Adv. Appl. Math. 2:482 (Smith等人，1981年，《应用数学进展》，第2卷，第482页）的局部 同源性算法；Pearson et al. (1988)Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444(Pearson 等人，1988 年，《美国国家科学院院刊》，第85卷，第2444页）的相似性搜索方法；Smith-Waterman 算法（Meth. Mol. Biol. 70:173-187(1997)(《分子生物学方法》，第70卷，第173-187页， 1997 年）；以及 BLASTP、BLASTN 和 BLASTX 算法（参见 Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410(Altschul等人，1990年，《分子生物学杂志》，第215卷，第403-410 页））。
[0108] 使用这些算法的计算机化程序也可供使用，并且包括但不限于：ALIGN 或 Megalign(DNASTAR)软件、或 WU-BLAST-2(Altschul et al.，（1996)Meth. Enzym.，266:460-480 (Altschul 等人，1996 年，《酶学方法》，第 266 卷，第 460-480 页））；或 美国威斯康星州麦迪逊（Madison, Wisconsin, USA)的遗传学计算组（Genetics Computing Group(GCG))软件包版本8中可获得的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA ;以及加利福 尼亚州山景城的 Intelligenetics 公司(Intelligenetics, Mountain View, California) 所开发的PC/Gene程序中的CLUSTAL。本领域的技术人员可确定用于测量比对的适当参数， 包括在正进行比较的序列的长度上实现最大比对所需的算法。优选地，使用由程序确定的 默认参数来确定序列同一 1性。具体地讲，可使用Clustal W(Thompson J. D. et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4673-4680 (Thompson J.D.等人，1994 年，《核酸研宄》，第 22 卷，第 4673-4680页））以以下默认参数确定序列同一性，即：
[0109]
【主权项】
1. 一种重组多肽，所述重组多肽包含与SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:3的氨基酸序列具 有至少85%同一性的氨基酸序列，其中所述多肽具有0 -葡糖苷酶活性。
2. 根据权利要求1所述的重组多肽，其中当所述重组多肽和里氏木霉（Trichoderma reesei)Bgll用于水解木素纤维素生物质底物时，与所述里氏木霉（Trichoderma reesei) Bgll相比，所述多肽具有改善的0 -葡糖苷酶活性。
3. 根据权利要求1或2所述的重组多肽，其中所述改善的0 -葡糖苷酶活性是增强的 纤维二糖酶活性。
4. 根据权利要求1-3中任一项所述的重组多肽，其中所述改善的0 -葡糖苷酶活性是 在相同的糖化条件下，从木素纤维素生物质获得增加的葡萄糖收率以及相等或更低的总糖 收率。
5. 根据权利要求4所述的重组多肽，其中所述木素纤维素生物质在糖化之前进行预处 理。
6. 根据权利要求1-5中任一项所述的重组多肽，其中所述多肽包含与SEQ ID NO: 2或 SEQ ID N0:3的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。
7. 根据权利要求1-5中任一项所述的重组多肽，其中所述多肽包含与SEQ ID NO: 2或 SEQ ID N0:3的氨基酸序列具有至少95%同一性的氨基酸序列。
8. -种组合物，所述组合物包含根据权利要求1-7中任一项所述的重组多肽，还包含 一种或多种其他纤维素酶。
9. 根据权利要求8所述的组合物，其中所述一种或多种其他纤维素酶选自无或一种或 多种其他0 -葡糖苷酶、一种或多种纤维二糖水解酶和一种或多种内切葡聚糖酶。
10. -种组合物，所述组合物包含根据权利要求1-7中任一项所述的重组多肽，还包含 一种或多种半纤维素酶。
11. 根据权利要求8或9所述的组合物，还包含一种或多种半纤维素酶。
12. 根据权利要求10或11所述的组合物，其中所述一种或多种半纤维素酶选自一种或 多种木聚糖酶、一种或多种0 -木糖苷酶，以及一种或多种L-阿拉伯呋喃糖苷酶。
13. -种核酸，所述核酸编码根据权利要求1-7中任一项所述的重组多肽。
14. 根据权利要求13所述的核酸，其中所述多肽还包含信号肽序列。
15. 根据权利要求14所述的核酸，其中所述信号肽序列选自SEQ ID NO: 13-42。
16. -种表达载体，所述表达载体包含与调控序列有效组合的根据权利要求13-15中 任一项所述的核酸。
17. -种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求16所述的表达载体。
18. 根据权利要求17所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为细菌细胞或真菌细胞。
19. 一种组合物，所述组合物包含根据权利要求17或18所述的宿主细胞以及培养基。
20. -种产生0 -葡糖苷酶的方法，包括：将根据权利要求17或18所述的宿主细胞在 合适的条件下培养于培养基中以产生所述葡糖苷酶。
21. -种组合物，所述组合物包含根据权利要求20所述的方法产生于所述培养基上清 液中的所述葡糖苷酶。
22. -种用于水解木素纤维素生物质底物的方法，包括：使所述木素纤维素生物质底 物与根据权利要求1-7中任一项所述的多肽或者根据权利要求21所述的组合物接触，以得 到葡萄糖和其他糖。
【专利摘要】本发明组合物和方法涉及源自土曲霉(Aspergillus terreus)的β-葡糖苷酶、编码所述β-葡糖苷酶的多核苷酸、以及其制备和/或使用方法。包含所述β-葡糖苷酶的制剂适用于水解木素纤维素生物质底物。
【IPC分类】C12N9-42
【公开号】CN104812895
【申请号】CN201380056655
【发明人】B·S·鲍尔, M·K·福达拉
【申请人】丹尼斯科美国公司
【公开日】2015年7月29日
【申请日】2013年10月30日
【公告号】CA2888757A1, EP2914719A1, US20150252340, WO2014070841A1