使用改良的肠杆菌科菌株发酵产生l-氨基酸的方法

使用改良的肠杆菌科菌株发酵产生l-氨基酸的方法
【专利说明】使用改良的肠杆菌科菌株发酵产生L-氨基酸的方法
[0001] 本发明涉及使用具有弱化的ProP基因的肠杆菌科微生物发酵产生L-氨基酸的方 法，适于所述生产的微生物及编码ProP转运蛋白的变体的多核苷酸。
[0002] 有机化合物，特别是含硫L-氨基酸具有重大的经济学意义。L-半胱氨酸用作食品 补充剂，用作药物学活性化合物（例如N-乙酰半胱氨酸）及化妆品的起始物。氨基酸L-甲 硫氨酸在动物营养中起重要作用，是在脊椎动物代谢中不能生物合成产生的必需氨基酸之 一。因此，在动物饲养中，必须保证随着饲料摄取足够量的特定氨基酸。然而，由于L-甲 硫氨酸通常以太低的量存在于常规饲料植物（如大豆或谷物）中，不能保证最佳的动物营 养，特别是对于猪和家禽，有利的是掺入甲硫氨酸作为动物饲料的添加物。脊椎动物可以将 D-甲硫氨酸转变为生物活性L-甲硫氨酸。因此，通常将D-和L-甲硫氨酸的外消旋体加入 动物饲料中。动物通过转甲基作用可以将L-高半胱氨酸转变为L-甲硫氨酸，前者因此可 代替后者。
[0003] 下文提及的有机化合物是指选自L-氨基酸，优选含硫L-氨基酸，特别是L-甲硫 氨酸、L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-高半胱氨酸和L-高胱氨酸的一或多种化合物。优选L-甲 硫氨酸。
[0004] 在现有技术中，氨基酸如甲硫氨酸是通过化学合成制备的。这包括首先使丙烯醛 与甲硫醇反应产生3-(甲硫基）丙醛，其依次与氰化物、氨和一氧化碳产生乙内酰脲。最终， 后者可以水解为外消旋体，两种立体异构体D-和L-甲硫氨酸的等摩尔混合物。由于分子 的生物活性形式仅呈现为L形式，因此饲料中存在的D形式必须首先通过脱氨和转氨作用 经代谢地转变为活性L形式。
[0005] 与甲硫氨酸不同，大多数其它天然的蛋白原性氨基酸如L-苏氨酸是通过微生物 发酵鉴定制备的。这是利用微生物具有合适的合成天然氨基酸的生物合成途径。此外，许 多发酵方法通过使用廉价的反应物如葡萄糖和无机盐实现非常有利的生产成本，并且也实 现特定氨基酸的生物活性L形式。
[0006] 已知有机化合物可以通过肠杆菌科，特别是大肠杆菌（E. coli)和粘质沙雷氏菌 的菌株发酵而产生。由于其显著性，不断进行尝试以改良制备方法。生产方法的改良可涉 及发酵技术，例如搅拌和供氧，或营养培养基的组分如发酵期间使用的糖的选择及糖浓度， 或产物形式的加工方法，例如通过离子交换层析，或微生物本身的固有生产性质。
[0007] 野生型菌株中氨基酸的生物合成途径受到严格代谢控制，以保证氨基酸仅为细胞 固有的需要而生产。因此，对于有效的生产方法的一个重要先决条件是用于制备希望的氨 基酸的合适的微生物的可利用性，与野生型生物体不同，所述合适的微生物具有大幅度增 加的生产产量、超过固有需要（过量生产）。
[0008] 这种过量产生氨基酸的微生物可以通过传统的突变/选择方法和/或通过现代的 特定的重组技术（代谢工程）产生。后者包括首先鉴定由于其修饰、激活或失活而影响氨 基酸过量产生的基因或等位基因。然后将这些基因/等位基因导入微生物菌株中或者使用 分子生物学技术使其失活以实现最佳的过量生产。然而，通常只有组合多个不同的措施才 能导致真正有效的生产。
[0009] L-甲硫氨酸与赖氨酸和苏氨酸都衍生自天冬氨酸。将硫以L-半胱氨酸形式（通过 胱硫醚作为中间物）通过转硫化导入L-甲硫氨酸中。L-甲硫氨酸的013基团源自Cl代谢并 由MetE或MetH甲硫氨酸合酶转移至L-高半胱氨酸（参见：Greene RC(1996)in Neidhardt FC et al. (eds.) "Escherichia coli and Salmonella"，2nd edition, ρρ· 542-560)。例 如，发酵生产L-甲硫氨酸的菌株和方法已经在W02006/001616或W02009/043803中有对于 大肠杆菌的描述。
[0010] ProP是大肠杆菌质子/相容性溶质同向转运蛋白，并且因此是大肠杆菌中 在高渗条件下酷游活性的转运蛋白之一（Grothe et al.，Journal of Bacteriology 166,253-259(1986) ；Racher et al. , Biochemistry 38,1676-1684(1999) ；ffood, Methods in Enzymology 428,77-107(2007))。在细胞周围培养基的渗透压增加时，培养基的水 势降低并且水分子沿着细胞外的渗透压梯度扩散。细胞的膨压降低，随后，胞质蛋白丧 失其功能性相关水化层。这种脱水的结果是，细胞代谢好和细胞分裂停止。为了阻止这 种现象，微生物已经在进化过程中进化出不同策略，例如通过合成和/或吸收已知的相 容性溶质。如果这些天然存在的保护剂如脯氨酸或甘氨酸甜菜碱可外部获得，其吸收较 快及也是更有利的，吸收优选于微生物自身合成（Wood, Microbiology and Molecular Biology Reviews 63,230-262(1999))。ProP同向转运蛋白属于MFS家族（主要协同 蛋白超家族（major facilitator superfamily))，催化脯氨酸、甘氨酸甜菜碱、脯氨酸 甜菜碱、伊克多因及其它结构相似的底物与质子在高渗条件下协同吸收进细胞中。ProP 是在复水（rekonstituierten)的系统中检测到渗透感受和渗透调节性质的第一种转 运蛋白。C末端结构域能形成卷曲螺旋基序。这个结构域的形成对于渗透调节是重 要的，并且可能对于渗透刺激感受是重要的（Culham et al·，Journal of Molecular Recognition 13,309-322(2000))。ProP通过钾离子浓度的内部升高及使用不同链长度 的聚乙二醇（PEG)在脂蛋白体中模拟大分子拥挤而激活（Racher et al. ,Biochemistry 40,7324-7333(2001) ;Culham et al.，Biochemistry42, 410-420 (2003))。尽管 ProP 能不 用另外的因子而感受到渗透压情况，但是载体在体内的完全活性需要存在胞质ProQ蛋白 (Kunte et al. , Journal of Bacteriology 181, 1537-43 (1999))〇
[0011] 因此，大肠杆菌ProP转运蛋白在渗透调节中的功能很久前就是已知的。
[0012] 令人惊奇地，本发明发现肠杆菌科微生物生产L-氨基酸可以通过弱化proP基因 而增加。
[0013] 本发明的目的是提供使得含硫氨基酸，特别是L-甲硫氨酸，的过量产生可以增加 的方法和微生物。
[0014] 发明描述
[0015] 本发明的第一方面是通过肠杆菌科微生物发酵产生L-氨基酸或者含有L-氨基酸 的饲料添加物的方法，特征在于应用其中ProP基因已经弱化的微生物。
[0016] 所述微生物产生L-氨基酸并将其优选分泌到周围的培养基中。
[0017] 此外，所述微生物导致L-氨基酸优选在培养基中和/或细胞内部积聚（积聚），特 别优选在培养基中积聚。
[0018] 因此，本发明另一方面也是肠杆菌科微生物，其具有弱化的prop基因，特征在于 其产生L-氨基酸并优选将其分泌到培养基中，优选导致L-氨基酸在培养基中和/或细胞 内部积聚，优选在培养基中积聚。
[0019] 优选地，与所应用的无弱化的prop基因的起始菌株或亲代菌株相比，在发酵方法 中，本发明的微生物显示增加的希望的L-氨基酸的产生及优选分泌。
[0020] 根据本发明，"弱化"是指proP基因以低水平表达或者已经完全被关闭。
[0021] 在本发明中，术语"弱化"描述了，通过例如使用比在未针对各酶或蛋白质重组的 微生物或亲代菌株中的启动子弱的启动子，或者使用编码各低活性的酶或蛋白质的基因或 等位基因，或失活各酶或蛋白质或开放读框或基因，及，如果需要，组合使用这些方法，降低 或消除微生物中由相应DNA，特别是本文的proP基因编码的一或多种酶或蛋白质，特别是 ProP转运蛋白的胞内活性或浓度。
[0022] 弱化措施通常使各蛋白质的活性或浓度降低至野生型蛋白质或者未针对各酶或 蛋白质重组的微生物或亲代菌株中蛋白质活性或浓度的0-75 %、0-50 %、0-25 %、0-10 %或 者0-5%。非重组微生物或亲代菌株是指根据本发明进行弱化或消除的微生物。
[0023] 弱化可以通过例如降低或消除基因或开放读框的表达或者酶蛋白质的催化活性 而实现。可以组合适当这两种措施。
[0024] 基因表达可以通过合适的培养方法、通过遗传修饰（突变）基因表达的信号 结构或者通过反义RNA技术而降低。举例的基因表达的信号结构是阻抑基因、激活基 因、操纵子、启动子、弱化子、核糖体结合位点、起始密码子和终止子。关于这方面的信 息可由本领域技术人员在例如 Jensen 和 Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58:191-195(1998))、 Carrier 和 Keasling(Biotechnology Progress 15:58-64(1999))、 Franch 和 Gerdes (Current Opinion in Microbiology 3:159-164 (2000))、Kawano 等 (Nucleic Acids Research 33(19),6268-6276(2005))及已知的遗传和分子生物学教科书 中找到，所述教科书例如 Knippers ("Molekulare Genetik"，6th edition, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany, 1995)或者 Winnacker ( "Gene und Klone"，VCH Verlagsges ellschaft，Weinheim, Germany, 1990)所著教科书。
[0025] 本领域已经揭示了导致酶蛋白质催化性质改变或降低的突变，例如下列研宄： Qiu 和 Goodman(Journal of Biological Chemistry 272:8611-8617(1997))、 Yano 等 (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 95:5511-5515 (1998))、Wente和 Schachmann (Journal of Biological Chemistry 266:20833-20839 (1991))。概述可见于已知的遗传和分子生物学教科书，例如Hagemann所 著的（"Allgemeine Genetik"，Gustav Fischer Verlag，Stuttgart, 1986) 〇
[0026] 可以考虑的突变是转换、颠换、插入和删除至少一个碱基对或核苷酸。根据突变所 致氨基酸取代对酶活性的作用，称作错义突变或无义突变。错义突变导致蛋白质中指定氨 基酸由不同的氨基酸取代，特别是非保守氨基酸取代。这样削弱了所述蛋白质的功能或活 性，所述功能性或活性降低至0-75 %、0-50 %、0-25 %、0-10 %或者0-5 %。无义突变导致基 因的编码区内的终止密码子，因此翻译被过早终止。在基因中插入或删除至少一个碱基对 导致移码突变，结果是掺入不正确的氨基酸或者翻译过早终止。如果终止密码子是由于突 变而在编码区内产生，其同样导致翻译过早终止。同样，删除至少一个或多个密码子通常导 致酶活性的全部丧失。WO 03/074719描述了用合适的t-RNA阻抑物抑制编码区内终止密码 子突变而降低基因表达。
[0027] 产生这种突变的教导属于现有技术，可于已知的遗传学和分子生物学教科 书中找到，例如 Knippers( "Molekulare Genetik"，6th edition, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany, 1995)、Winnacker( "Gene und Klone^1VCH Verlagsgesells chaft, Weinheim, Germany, 1990)或者 Hagemann ("A1 lgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986)所著的教科书。
[0028] 特别地，"弱化"和"低水平表达"是关于proP基因，是指ProP转运蛋白的活性和 /或浓度通过如上述措施，降低至野生型蛋白质的活性和/或浓度，或者在ProP转运蛋白非 重组的微生物或亲代菌株中蛋白质的活性和/或浓度的0-75%、0-50%、0-25%、0-10%或 0-5 % 〇
[0029] 根据本发明，L-氨基酸优选通过微生物过量生产。"过量生产"是指根据本发明关 于L-氨基酸的生产性能大幅度增加超过微生物固有需要。
[0030] 本发明的L-氨基酸优选是含硫氨基酸，特别是L-甲硫氨酸、L-半胱氨酸、L-胱氨 酸、L-高半胱氨酸或L-高胱氨酸，特别优选L-甲硫氨酸。
[0031] 优选地，本发明的微生物及在本发明方法中应用的微生物优选地特征在于与不具 有弱化的ProP基因的微生物相比具有增加的甲硫氨酸耐受性。优选地，其甚至能在50或 60克每升的甲硫氨酸浓度，特别优选在70、75、80、90或100克每升的甲硫氨酸浓度生长，因 为其对这些甲硫氨酸浓度具有抗性。本文关于L-甲硫氨酸的耐受性数据优选基于具有相 应L-甲硫氨酸浓度的基本琼脂。
[0032] 这种甲硫氨酸-抗性菌株可以从已经产生L-甲硫氨酸的大肠杆菌菌株开始，通过 在含有甲硫氨酸的最小琼脂上选择而分离。
[0033] 本发明的甲硫氨酸-抗性菌株是优选使用本领域描述的选择方法产生的，所述方 法尤其可参见 Miller (A Short Course in Bacterial Genetics, A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992))或者"Manual of Methods for General Bacteriology"of the American Society for Bacteriology(Washington D. C.，USA)〇
[0034] 因此，本发明的另一方面是鉴定肠杆菌科微生物的方法，去能使含硫氨基酸，优选 L-甲硫氨酸以改良的方式产生，其具有弱化的proP基因，所述方法包括如下步骤：
[0035] a)筛选具有增加的甲硫氨酸耐受性的肠杆菌科微生物，其能产生含硫L-氨基酸， 优选L-甲硫氨酸；
[0036] b)分离并增殖在a)中产生的突变体；
[0037] c)任选地，提供来自在b)中获得的突变体的核酸；
[0038] d)任选地，通过使用聚合酶链式反应从来自c)的核酸和引物对开始制备核酸分 子，所述引物对包含第一引物和第二引物，所述第一引物包含SEQ ID N0:38的核苷酸序列 的位置1-1000中的至少15个连续核苷酸，所述第二引物包含SEQ ID NO: 38的序列互补序 列的位置2504-3503中的至少15个连续核苷酸；
[0039] e)任选地，确定在d)中获得的核酸分子的核苷酸序列，及确定所编码的氨基酸序 列；
[0040] f)任选地，将在e)中确定的氨基酸序列与SEQ ID NO:2进行比较；及
[0041] g)任选地，鉴定所获得的proP突变体。
[0042] 为了在proP基因中特异性地进行突变，可以使用定点诱变方法，所述 方法使用诱变的寡核苷酸（T.A.Brown:Gentechnologie flir Einsteiger[orig. title:Gene Cloning and DNA Analysi s~An Introduction], Spektrum Akademischer Verlag，Heidelberg，Germany，1993)或者聚合酶链式反应（PCR)，如 Gait:Oligonucleotide synthesis:A Practical Approach(IRL Press,Oxford, UKj 1984) 或 Newton and Graham(PCR，Spektrum Akademischer Verlagj Heidelberg, 1994)所 述D为了设计突变，可以使用例如来自Stratagene (Amsterdam，Netherlands)的Quick Change Site-Directed Mutagenesis试剂盒^使用这些方法包括借助于聚合酶链式反 应（PCR)从野生型菌株的分离的总DNA开始扩增现有技术中描述的proP基因，将所述 基因克隆进合适的质粒载体中，然后对所述DNA进行诱变D借助于"GeneSOEing"（Gene Splicing by Overlap Extension, Horton, Molecular Biotechnology 3:93-98(1995))， 甚至可以通过PCR获得点突变。核苷酸序列的从头开始的基因合成（例如通过GENEART AG, Regensburg，Germany)也可以用于在proP基因中产生突变D所产生的突变可以通过DNA 测序确定和检查，例如通过Sanger等（Proceedings of the National Academy of Science USA 74(12):5463-5467,1977)的方法。
[0043] 所产生的等位基因可以整合入合适菌株的染色体中，例如通过转化及基因或等位 基