评价细胞因子对细胞色素p450的代谢能力产生的影响的方法和药剂的筛选方法
【技术领域】
[0001] 本发明为评价细胞因子与细胞色素 P450的相互作用的方法，例如涉及评价由细 胞因子引起的细胞色素 P450的药物代谢功能的诱导和衰减的方法。另外，本发明为与细胞 因子相互作用的药剂的筛选方法。
【背景技术】
[0002] 近年来，关于细胞因子已经进行了各种研宄。
[0003] 例如，炎症性的自身免疫疾病的患者的白介素的血药浓度高于健康人，细胞色素 P450的代谢功能低于健康人，炎症时由于分泌至血中的细胞因子类而CYP3A4的代谢功能 降低，因此药剂无法排泄，作为结果，显示出会引起严重的副作用（非专利文献1)。对这样 的患者给予经受了细胞色素 P450的代谢的药物（Dl)时，估计该患者的代谢功能的降低程 度来给予少于健康人的量。对于这样的患者组合使用阻碍白介素的受体那样的、与细胞因 子相互作用的药剂（D2)(例如分子靶向药物）时，降低了的细胞色素 P450的代谢功能恢 复，药物（Dl)的代谢得到促进。其结果，临床研宄中示出药物（Dl)的作用减弱化（非专利 文献2)。出于这样的背景，分子靶向药物那样的药剂与经受了细胞色素 P450的代谢的药物 的介由细胞因子的相互作用的研宄备受关注。
[0004] 作为该方法之一，可以举出动物实验。然而，人与动物有种差，因此有无法准确地 预测生物体内的反应的问题（非专利文献3)。此外，动物实验那样的体内（in vivo)的试 验与体外（in vitro)系统相比，生产能力性能差。因此，有不适于同时评价大量化合物的 药物的筛选的问题。
[0005] 出于这样的背景，要求能够准确地预测生物体内的反应的基于in vitro的试验的 评价法。另外，以白介素为代表的细胞因子类作为药物开发靶标也受到关注，近年来要求用 于评价药剂与细胞因子的相互作用的in vitro系统。
[0006] 现有技术文献
[0007] 非专利文献
[0008] 非专利文献 I :Kenneth W. Renton 著、"Cytochrome P450 Regulation and Drug Biotransformation During Inflammation and Infection''、Current Drug Metabolism、 2004年 5 月、pp. 235-243
[0009] 非专利文献 2:Leslie J. Dickmann，Sonal Κ· Patel，Dan A. Rock，Larry C. Wienkersj and J.Greg Slatter 著、"Effects of Interleukin-6(IL-6)and an Anti-IL-6 Monoclonal Antibody on Drug-Metabolizing Enzymes in Human Hepatocyte Culture"、DRUG METABOLISM AND DISPOSITION 39、2011 年、pp. 1415-1422
[0010] 非专利文献 3:C Schmitt，B Kuhnl，X Zhang，AJ Kivitz3and S Grange 著、 uDisease-Drug-Drug Interaction Involving Tocilizumab and Simvastatin in Patients With Rheumatoid Arthritis''、Clinical pharmacology&Therapeutics、VOLUME 89 NUMBER 5、2011 年 5 月、ρρ· 735-740
【发明内容】
[0011] 发明要解决的问题
[0012] 作为in vitro的试验，非专利文献3中公开了使用人原代肝细胞的方法。然而， 人原代肝细胞对于由供体的基因多态性、环境因素导致的药物动态基因的表达量及其诱导 能力的批间差异大。此外，获得途径受到限制，因此成本高、操作困难。因此，存在难以使用 多种细胞因子，以同一批的细胞一次性评价多个细胞色素 P450、或者需要较大成本的问题。
[0013] 另一方面，可以使株化肝细胞增殖。因此，评价细胞因子对细胞色素 P450的代谢 能力产生的影响的方法中，如果能利用源自人的株化肝细胞，则可以期待能够得到廉价且 有重现性的结果。然而，已知的是，株化肝细胞的代谢功能所具有的肝细胞的功能与原代肝 细胞相比，非常低。例如，使用用来培养细胞的底部表面平坦的培养容器培养株化肝细胞 时，有时细胞色素 P450的代谢能力变为测定极限值以下，无法进行分析。这样的情况下，即 使在不添加细胞因子的对照组中也可以检测到代谢功能，测定添加细胞因子时的代谢功能 的衰减量也是极为困难的。为了克服该问题，已经研宄了各种三维培养，但存在操作烦杂、 需要使用特殊的装置、或为高成本之类的问题。出于这样的背景，使用株化肝细胞评价细胞 因子对细胞色素 P450的代谢能力产生的影响的方法尚未开发。
[0014] 发明人等发现了评价细胞因子对细胞色素 P450的代谢能力产生的影响的方法以 及与细胞因子相互作用的药剂的筛选方法中利用株化肝细胞的方法。
[0015] 用于解决问题的方案
[0016] 发明人等利用使球状体形状的株化肝细胞与包含细胞因子的试验溶液接触1小 时以上且小于96小时后测定细胞色素 P450的代谢能力的方法解决了上述问题。
[0017] 本发明的评价细胞因子对细胞色素 P450的代谢能力产生的影响的方法的一个方 案为，使球状体形状的株化肝细胞与包含细胞因子的试验溶液在培养容器内接触1小时以 上且小于96小时后，评价细胞色素 P450的代谢功能的诱导或衰减的有无。发现：通过形成 球状体形状的株化肝细胞，使所形成的球状体形状的株化肝细胞与试验溶液接触适合的时 间，从而能够测定代谢功能。根据该方法，测定并评价细胞因子对细胞色素 P450的代谢能 力产生的影响成为可能。
[0018] 另外，本发明的评价细胞因子对细胞色素 P450的代谢能力产生的影响的方法的 一个方案中，优选的是，由前述株化肝细胞形成的球状体的直径的平均值为50 μπι以上且 小于200 μ m，且具有半值宽度范围内的直径的球状体为全部球状体的70%以上。通过球状 体的直径的大小为规定的范围内、且球状体的直径的大小的偏差变小，从而可以提高代谢 功能的判定的精度。
[0019] 进而，本发明的评价细胞因子对细胞色素 P450的代谢能力产生的影响的方法的 一个方案中，优选的是，前述试验溶液为无血清培养基。
[0020] 此外，优选的是，以健康人的细胞因子的血药浓度的平均值的0. 1倍至50倍的范 围中的一个浓度为基准，使用前述试验溶液的细胞因子浓度为前述基准的1倍、10倍、100 倍至少这3种浓度的包含前述细胞因子的各试验溶液。另外，优选的是，以前述细胞因子在 被分泌的疾病患者的血药浓度的平均值的0. 1倍至50倍的范围中的一个浓度为基准，使用 前述试验溶液的细胞因子的浓度为前述基准的1倍、10倍、100倍至少这3种浓度的包含细 胞因子的各试验溶液。
[0021] 本发明的方法的一个方案中，优选的是，在同一孔内进行将前述株化肝细胞培养 为球状体形状的工序、和使球状体形状的前述株化肝细胞和包含前述细胞因子的前述试验 溶液接触1小时以上且小于96小时的工序。
[0022] 例如，优选的是，使用具有多个孔的培养板的一个孔作为前述培养容器来进行以 下的各工序。
[0023] (1)在前述一个孔内，在包含10%血清的培养基中形成前述株化肝细胞的球状体 的工序；
[0024] (2)从前述一个孔吸取前述培养基的工序；
[0025] (3)向前述一个孔中添加包含前述细胞因子的前述试验溶液的工序；
[0026] (4)在前述一个孔内，使包含前述细胞因子的前述试验溶液与前述球状体接触1 小时以上且小于96小时的工序。
[0027] 此外，发明人等利用使球状体形状的株化肝细胞、与包含细胞因子和药剂中的任 一者的试验溶液接触后测定细胞色素 P450的代谢能力的方法从而解决了上述问题。
[0028] 本发明的与细胞因子相互作用的药剂的筛选方法的一个方案为，准备不含前述细 胞因子和前述药剂的第一试验溶液、包含前述细胞因子且不含前述药剂的第二试验溶液、 以及包含前述细胞因子和前述药剂的第三试验溶液，
[0029] 使前述第一试验溶液至第三试验溶液与球状体形状的株化肝细胞接触，
[0030] 测定与前述第一试验溶液接触的前述株化肝细胞的细胞色素 P450的药物代谢酶 的功能，取得第一测定值，同样地测定与前述第二试验溶液和第三试验溶液接触的前述株 化肝细胞的细胞色素 P450的药物代谢酶的功能，取得第二测定值和第三测定值，
[0031] 前述第一测定值大于前述第二测定值且前述第二测定值小于前述第三测定值时， 判定前述药剂使细胞色素 P450的药物代谢功能恢复。
[0032] 发现：通过该方法，与细胞因子相互作用的药剂的筛选方法中能够利用株化肝细 胞。
[0033] 另外，本发明的筛选方法中，优选的是，由前述株化肝细胞形成的球状体的直径的 平均值为50 μ m以上且小于200 μ m，并且具有半值宽度范围内的直径的球状体为全部球状 体的70%以上。通过球状体的直径的大小为规定的范围内，且球状体的直径的大小的偏差 变小，从而可以提尚代谢功能的判定的精度。
[0034] 进而，本发明的筛选方法中，优选的是，前述试验溶液的溶剂为无血清培养基。
[0035] 此外，优选的是，前述第三测定值为前述第二测定值的3倍时，判定使细胞色素 P450的药物代谢功能恢复。
[0036] 进而，优选的是，前述第二试验溶液和第三试验溶液的细胞因子的浓度如下选择： 使包含至少3种浓度的细胞因子且不含前述药剂的溶液与前述株化肝细胞接触，对细胞色 素 P450的药物代谢酶的功能进行测定，选择所测得的测定值小于前述第一测定值的浓度， 其中所述包含至少3种浓度的细胞因子且不含前述药剂的溶液为，以健康人的细胞因子的 血药浓度的平均值的0. 1倍至50倍的范围中的一个浓度为基准，前述第二试验溶液和第三 试验溶液的细胞因子的浓度为前述基准的1倍、10倍、100倍至少这3种浓度的包含前述细 胞因子且不含前述药剂的溶液。另外，优选的是，前述第二试验溶液和第三试验溶液的细胞 因子的浓度如下选择：使包含至少3种浓度的细胞因子且不含前述药剂的溶液与前述株化 肝细胞接触，对细胞色素 P450的药物代谢酶的功能进行测定，选择所测得的测定值小于前 述第一测定值的浓度，其中所述包含至少3种浓度的细胞因子且不含前述药剂的溶液为， 以前述细胞因子在被分泌的疾病患者的血药浓度的〇. 1倍至50倍的范围中的一个浓度为 基准，前述第二试验溶液和第三试验溶液的细胞因子的浓度为前述基准的1倍、10倍、100 倍至少这3种浓度的包含前述细胞因子且不含前述药剂的溶液。
[0037] 本发明的筛选方法中，优选的是，在培养板的同一孔内进行将前述株化肝细胞培 养为球状体形状的工序、和使球状体形状的前述株化肝细胞与前述第一试验溶液至第三试 验溶液接触的工序。
[0038] 发明的效果
[0039] 根据本发明，评价细胞因子对细胞色素 P450的代谢能力产生的影响的方法以及 与细胞因子相互作用的药剂的筛选方法中能够利用株化肝细胞。
【附图说明】
[0040] 图1为示出本发明的一个实施方式中使用的培养板的整体的图。
[0041] 图2A为图1所示的培养板的II-II线截面图。
[0042] 图2B为图1所示的培养板的其他II-II线截面图。
[0043] 图3为示出本发明的一个实施方式中使用的培养容器的整体的图。
[0044] 图4为图3所示的培养容器的IV-IV线截面图。
[0045] 图5A为示出在培养空间中培养球状体的状态的概要图。
[0046] 图5B为示出说明在培养空间中培养的球状体的优选尺寸的一例的模式图的图。
[