以流通方式从生物药物制剂中去除蛋白质聚集体的制作方法
【专利说明】以流通方式从生物药物制剂中去除蛋白质聚集体
[0001] 本申请是申请日为2013年3月11日的第201310075551.X号发明名称为"以流通 方式从生物药物制剂中去除蛋白质聚集体"的中国专利申请的分案申请。
[0002] 相关申请
[0003] 本申请要求2012年3月12日提交的美国临时专利申请No. 61/609,533和2012 年6月29日提交的美国临时专利申请No. 61/666, 578的优先权，将其全文援引加入本文。 发明领域
[0004] 本发明涉及以流通（flow-through)方式从包含感兴趣的产物的生物药学制剂中 去除蛋白质聚集体的方法。
[0005]发明背景
[0006] 蛋白质聚集体是需要从包含感兴趣的产物，例如治疗性蛋白质或抗体分子的生物 药学制剂中去除的重要杂质之一。例如，蛋白质聚集体和其他污染物必须在产品用于诊断、 治疗或其它应用之前从包含感兴趣的产物的生物药学制剂中去除。此外，蛋白质聚集体还 常见于从杂交瘤细胞系得到的抗体制剂，并且需要在抗体制剂用于其目的用途之前去除。 在治疗性应用和用于获得食品药品管理局批准的情况中这是特别重要的。
[0007] 蛋白质聚集体的去除可能受到挑战，这是由于在生物药学制剂中，经常在蛋白质 聚集体和感兴趣的产物（其通常是单体分子）的物理和化学性质之间存在相似性。对于从 生物药学制剂中去除蛋白质聚集体，现有技术中已有许多不同方法，其包括例如体积排阻 色谱、离子交换色谱和疏水作用色谱。
[0008] 已知几种结合-洗脱式色谱方法用于蛋白质聚集体与感兴趣的产物的分离。 例如，羟基磷灰石已用于蛋白质、核酸以及抗体的色谱分离。在羟基磷灰石色谱中，将 柱常规地平衡，然后施用低浓度磷酸盐缓冲液中的样品，然后以磷酸盐缓冲液的浓度梯 度洗脱被吸附的蛋白质（参见例如Giovannini,BiotechnologyandBioengineering 73:522-529(2000))。但是，在多种情况中，研究人员不能选择性地从羟基磷灰石 洗脱抗体，或发现羟基磷灰石色谱不产生足够纯的产品（参见，例如Jungbauer,J. Chromatography476:257-268(1989) ；Giovannini,BiotechnologyandBioengineeri ng73:522-529 (2000))。
[0009] 此外，一种市售的色谱树脂，陶瓷羟基磷灰石（CHT)已较成功地以树脂模式用于 蛋白质聚集体的去除（BI0RADC0RP，另参见例如美国专利公布W0/2005/044856)，但其一般 是昂贵的，并显示出对蛋白质聚集体的低结合容量。
[0010] 已有人描述了一种结合-洗脱式阳离子交换色谱方法，其有时在用于聚集体去除 的工业中使用（参见例如美国专利6, 620, 918)，但是，常发现单体收率和聚集体去除之间 不利的折衷性需克服。在从单克隆性抗体溶液中去除聚集体的方法的近期综述中，关注一 种结合-洗脱式色谱方式一 "阳离子交换色谱可能是一种分离聚集体和单体的有效方法， 但它可能难以发展成高收率并具有高容量的阶段。"参见例如Aldington等人，J.Chrom. B，848(2007)64 - 78。
[0011] 与现有技术中已知的结合-洗脱式方法和体积排阻色谱方法相比，以流通方式的 蛋白质纯化被认为是更令人期待的，这是由于较好的经济性、简易性、省时和缓冲液的节 省。
[0012] 现有技术中已尝试使用基于疏水作用色谱（HIC)介质的流通式聚集体去除（参见 例如美国专利7, 427, 659)。但基于HIC的制备性分离具有窄应用性，这是因为通常方法发 展困难，操作窗口窄，并且缓冲液所需的盐浓度高。
[0013] 弱分配色谱（WPC)是另一种色谱操作方式，其中产物比结合-洗脱式色谱情况中 的结合更弱，但比流通式色谱情况中的结合更强（参见例如美国专利8,067，182);但硏^ 也具有一些与其相关的缺点，包括窄操作窗口和与结合-洗脱式方法相比更低的杂质去除 容量。
[0014] 虽然现有技术中描述的流通式方法中一些已报道用于结合聚集体，但是相对于感 兴趣的产物，结合聚集体的特异性低。此外，现有技术中似乎没有已知的方法显示出对于结 合低级蛋白质聚集体，例如二聚体、三聚体和四聚体的高特异性。
【发明内容】
[0015] 本发明提供新型且改进的组合物以及将所述组合物用于在生物药学组合物中将 感兴趣的产物，例如治疗性抗体或单体蛋白质与蛋白质聚集体分离的流通式方法。本文所 述的组合物和方法特别可用于感兴趣的单体蛋白质与一般难以与单体蛋白质分离的低级 蛋白质聚集体，例如二聚体、三聚体和四聚体的分离。
[0016] 本发明至少部分地基于流通方式中的表面与感兴趣的产物（即单体分子）相比更 高的蛋白质聚集体的结合选择性，由此将蛋白质聚集体与感兴趣的产物分离。通过具有特 定密度的阳离子交换结合基团的表面的独特设计，本发明可实现该目的，由此有助于使比 单体分子相比更大量的蛋白质聚集体结合在表面上。
[0017] 在本发明的一些实施方案中，提供将样品中的感兴趣的单体蛋白质与蛋白质聚 集体分离的流通式色谱方法，其中所述方法包括将样品与固体载体接触，由此将感兴趣的 单体蛋白质与蛋白质聚集体分离，所述固体载体包含一种或多种与其连接的阳离子结合基 团，其密度为约1-约30mM，其中所述固体载体选择性地结合蛋白质聚集体。
[0018] 在一些实施方案中，本发明方法中使用的固体载体选自色谱树脂、膜、多孔整体料 (mono1ith)、机织织物和无纺织物。
[0019] 在一些实施方案中，所述固体载体包括色谱树脂或多孔球。
[0020] 在一些实施方案中，所述固体载体是多孔的聚乙烯醚的高分子微球或多孔的交联 聚甲基丙烯酸酯的聚合物球。
[0021] 在一些实施方案中，所述色谱树脂或多孔球的平均粒径为约50iim，或约10-约 500iim之间、或约20-约140iim之间、或约30-约70iim之间。
[0022] 在一些实施方案中，固体载体选自平均粒径为10iim-500iim之间或20-200iim之 间或20-90ym之间的色谱树脂或多孔球。在一个特定实施方案中，所述色谱树脂或多孔球 的平均粒径为约50ym。通常，选择性可随着粒径降低而改善。本领域技术人员将理解根据 特定应用或方法的需求可调节平均粒径，同时保持一定水平的用于结合蛋白质聚集体的选 择性。
[0023] 在一些实施方案中，所述蛋白质聚集体是低级蛋白质聚集体，例如二聚体、三聚体 和四聚体。
[0024] 在其他实施方案中，所述蛋白质聚集体是高级蛋白质聚集体，例如五聚体和更高 级聚集体。
[0025] 在一些实施方案中，本发明方法中使用的阳离子交换基团选自磺酸基（sulfonic group)、硫酸基（sulfategroup)、勝酸基（phosphonicgroup)、憐酸基（phosphoric group)和羧酸基（carboxylicgroup) 〇
[0026] 在一些实施方案中，所述单体蛋白质是抗体。在一个特定实施方案中，所述抗体是 单克隆抗体。在其他实施方案中，所述单体蛋白质是重组蛋白质，例如Fc-融合蛋白质。在 另外的其他实施方案中，所述单体蛋白质是非抗体的分子。
[0027] 在本发明的一些实施方案中，提供将样品中的感兴趣的单体蛋白质与蛋白质聚 集体分离的流通式色谱方法，其中所述方法包括将样品与固体载体接触，由此将感兴趣的 单体蛋白质与蛋白质聚集体分离，所述固体载体包含一种或多种与其连接的阳离子结合基 团，其密度为约1-约30mM，其中所述固体载体选择性地结合蛋白质聚集体，相对于单体，其 选择性大于约10。
[0028] 在其他实施方案中，提供降低样品中的蛋白质聚集体浓度的流通式色谱方法，所 述方法包括以下步骤：（