寡肽cd08及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于蛋白质领域，特别涉及寡肽及其应用。
【背景技术】
[0002] 寡肽是多肽的一种分类，分子量段一般在1000道尔顿以下，也称作小肽，一般由 2-6个氨基酸组成。
[0003] 炎症是具有血管系统的活体组织对损伤因子所发生的防御反应。对机体的损伤的 局部组织所呈现的反应称为炎症反应，炎症发展后期会产生渗出液，渗出物的压迫和炎症 介质的作用可引起患者疼痛。现在抗炎的临床应用药物主要为化学合成药物，如萘丁美 酮、吲哚美辛、吡罗昔康、布洛芬等，这些化学药物虽然抗炎效果明显，但不能治本，不能 消除致炎的基本原因，大多都有较严重的不良反应，给患者造成痛苦和损失。
[0004] 创面修复，创面是正常皮肤(组织）在外界致伤因子如外科手术、外力、热、电流、化 学物质、低温以及机体内在因素如局部血液供应障碍等作用下所导致的损害。常伴有皮肤 完整性的破坏以及一定量正常组织的丢失，同时，皮肤的正常功能受损。也称为伤口或者创 伤。创面修复既伤口修复。
[0005] 消化道溃疡病，胃溃疡、十二指肠溃疡统称为消化道溃疡病。由于生活节奏加快， 工作压力加大，近年消化道溃疡病的发病率不仅未见下降，反有上升趋势。近10多年来本 病的症状也变得不典型，无规律的胃部隐痛常引不起人们的注意，直到发生呕血或黑便时 方到医院就诊。消化性溃疡主要指发生在胃和十二指肠的慢性溃疡，亦可发生于食管下段、 胃空肠吻合口周围及含有异位胃粘膜的美克尔（MECKEL)憩室。这些溃疡的形成与胃酸和 胃蛋白酶的消化作用有关，故称消化性溃疡。近年研究发现溃疡的形成与幽门螺旋桿菌（H P)的存在有关。本病绝大多数（95%以上)位于胃和十二指肠，故又称胃十二指肠溃疡。本 病的总发病率占人口的5-10%，十二指肠溃疡较胃溃疡多见，以青壮年多发，男多于女，儿 童亦可发病，老年患者所占比例亦逐年有所增。由于复发率很高，给患者带来痛苦。
[0006] 免疫力是人体自身的防御机制，是人体识别和消灭外来侵入的任何异物(病毒、细 菌等）；处理衰老、损伤、死亡、变性的自身细胞以及识别和处理体内突变细胞和病毒感染细 胞的能力。现代免疫学认为，免疫力是人体识别和排除"异己"的生理反应。年老体弱的人 员由于自身免疫系统较弱，所以需要提高细胞的识别能力。免疫力低下是会造成人体容易 受到外界的感染，功能下降。
【发明内容】
[0007] 为了寻找一种可以多角度保护人体创面和抗炎镇痛，同时提高人体免机能的药 物，发明人通过大量合成试验，广泛的筛选，采用Fmoc保护的氨基酸来合成，得到大量寡肽 分子，其中部分寡肽分子获得了意想不到的技术效果。意外地发现治疗效果较好的寡肽 ⑶08:由E、Y2个氨基酸残基组成，分子量为310. 31Da，其氨基酸序列如SEQID:1所示。
[0008] 上述寡肽的制备方法可以使用合成，也可以采用从生物体中提取纯化得到。发明 提供一种寡肽的制备方法，其特征在于包括如下的步骤：
[0009]a.合成顺序为从C端到N端；取1倍摩尔当量的树脂放入多肽合成仪反应器中， 加入DCM(二氯甲烷）溶胀半小时，然后抽掉DCM，加入序列中第一个Fmoc保护的氨基酸 10mmol，2倍摩尔当量的DIEA(二异丙基乙胺），适量的DMF(二甲基甲酰胺）、DCM溶液(适 量是指以可使树脂充分鼓动起来为宜)，用氮气鼓泡反应60min;然后加入约5倍摩尔当量 甲醇，反应半小时，抽掉反应液，用DMF、甲醇洗净；
[0010]b.加入适量哌啶去除Fmoc(9-芴甲氧羰基）保护基，洗净，茚三酮检测；
[0011]c.往反应器中加入序列中第二个氨基酸（也为2倍摩尔当量)，2倍摩尔当量HBTU(苯并三氮唑-N，N，N'，N' -四甲基脲六氟磷酸盐）及DIEA，氮气鼓泡反应半小时；
[0012]d.抽掉液体，用DMF洗净，茚三酮检测；
[0013]e.将树脂用氮气吹干后，从反应柱中取下并称取重量，倒入烧瓶中，然后往烧瓶中 加一定量的95%TFA(三氟乙酸)切割液，震荡反应2h，目的是将多肽从树脂载体上裂解下来 并去除氨基酸的侧链保护基团；
[0014]f.滤掉树脂，得到滤液，然后向滤液中加入大量乙醚，析出粗产物，然后离心，清洗 即可得到该序列的粗产物；
[0015] g.分析提纯和质谱检测：用ESI(电喷雾电离)离子源质谱仪和测序仪检测该序列 的正确性，用高效液相色谱将粗品提纯至要求纯度；
[0016] h.收集纯化好的目标寡肽溶液放入冻干机中进行浓缩，冻干成白色粉末。
[0017] 本发明提供的寡肽可作为普通食品、保健品或者药品的组成部分。本发明还提供 一种寡肽的组合物，其中含有药学可以接受的载体。组合物可以以药物制剂形式存在，优选 的是注射剂，更优选的是冷冻干燥注射剂，该药物制剂形式药物组合物，可以按照制剂学常 规技术制备，包括将药物活性成分，本发明的寡肽与药物载体混合，按照制剂学常规技术制 成所需要的剂型。
[0018] 本发明中的寡肽，分子量小、人工合成方便、纯度很高，生产方面，适合大规模生 产，在应用方面，这些寡肽抗炎镇痛效果明显，对创面损伤、烧伤、烫伤、消化道溃疡具有显 著的治疗效果；该寡肽还有能提高动物免疫机能的作用，寡肽能够在制备抗菌、抗炎镇痛、 抗肿瘤和提高免疫力的药物中的应用。
【具体实施方式】
[0019] 以下是结合具体试验对本发明的说明，并不是对本发明保护范围的限制。实施例 1本发明中寡肽的制备方法
[0020]原料：树脂（WangResin),Fmoc保护的氨基酸，
[0021] 试剂：N,N-二甲基酰胺（DMF)，DCM，ME0H，乙酸酐，吡啶，DIEA，HBTU，六氢吡啶
[0022] 仪器：十二通道半自动多肽合成仪，高效液相色谱（HPLC)，型号：Waters2695检测 试剂：苯酚试剂，吡啶，茚三酮试剂
[0023] (1)合成顺序为从C端到N端。
[0024](2)取lOmmol当量的树脂放入多肽合成仪反应器中，加入DCM(二氯甲烷）溶胀 半小时，然后抽掉DCM，加入序列中第一个Fmoc保护的氨基酸lOmmol，20mmol的DIEA(二 异丙基乙胺），适量的DMF(二甲基甲酰胺）、DCM溶液(适量是指以可使树脂充分鼓动起来 为宜)，用氮气鼓泡反应60min。然后加入约50mmol当量甲醇，反应半小时，抽掉反应液，用DMF、甲醇洗净。
[0025] (3)加入适量哌啶去除Fmoc(9-芴甲氧羰基）保护基，洗净，茚三酮检测。
[0026] (4)往反应器中加入序列中第二个氨基酸(也为20mmol)，20mmolHBTU(苯并三氮 唑-N，N，N'，N' -四甲基脲六氟磷酸盐）及DIEA，氮气鼓泡反应半小时。
[0027] (5)抽掉液体，用DMF洗净，茚三酮检测。
[0028] (6)将树脂用氮气吹干后，从反应柱中取下并称取重量，倒入烧瓶中，然后往烧瓶 中加一定量的95%TFA(三氟乙酸)切割液，震荡反应2h，目的是将多肽从树脂载体上裂解下 来并去除氨基酸的侧链保护基团。
[0029] (7)滤掉树脂，得到滤液，然后向滤液中加入大量乙醚，析出粗产物，然后离心，清 洗即可得到该序列的粗产物。
[0030] (8)分析提纯和质谱检测：用ESI(电喷雾电离）离子源质谱仪检测该序列分子量 的正确性，用高效液相色谱将粗品提纯至要求纯度。
[0031] (9)收集纯化好的目标寡肽溶液放入冻干机中进行浓缩，冻干成白色粉末。
[0032] 实施例2寡肽对小鼠耳廓肿胀程度的影响，抗炎消肿镇痛的作用
[0033] 取昆明种小鼠，雌雄各半，体重25_30g，按样品量随机分组：每组10只。 HY01-HY24(250mg/kg)(2mg/ml)、萘丁美酮（250mg/kg)、生理盐水对照组（0?lml/10g)粗提 物剂量均折算为原动物生药剂量（下同）。各组均经口灌胃给药，对照组经口灌胃生理盐 水。各组每天灌胃1次，连续4d,末次灌胃2h后，尾静脉注射Evan'sblue50mg/kg,于 小鼠右耳双面涂二甲苯25ul/面，20h后，拉颈处死小鼠，沿耳廓基线剪下双耳，用直径 7. 5mm的打孔器分别在双耳同一部位打下圆耳片，电子天平称重，求出重量差，用以表示 肿胀度（肿胀度=左耳耳片重-右耳耳片重）。按以下公式计算肿胀抑制百分率。
[0034]抑制率（%) =(对照组平均肿胀度-给药组平均肿胀度）/对照组平均肿胀度*100%。
[0035]表1
【主权项】
1. 一种寡肽⑶08,其特征在于：由E、Y2个氨基酸残基组成，分子量为310. 31Da，其 氨基酸序列如SEQID: 1所示。
2. -种权利要求1所述寡肽的制备方法，其特征在于包括如下的步骤： a. 合成顺序为从C端到N端；取1倍摩尔当量的树脂放入多肽合成仪反应器中，加入 DCM(二氯甲烷）溶胀半小时，然后抽掉DCM，加入序列中第一个Fmoc保护的氨基酸IOmmol， 2倍摩尔当量的DIEA(二异丙基乙胺），适量的DMF(二甲基甲酰胺）、DCM溶液(适量是指以 可使树脂充分鼓动起来为宜)，用氮气鼓泡反应60min;然后加入约5倍摩尔当量甲醇，反应 半小时，抽掉反应液，用DMF、甲醇洗净； b. 加入适量哌啶去除Fmoc(9-芴甲氧羰基）保护基，洗净，茚三酮检测； c. 往反应器中加入序列中第二个氨基酸(也为2倍摩尔当量)，2倍摩尔当量HBTU(苯 并三氮唑-N，N，N'，N' -四甲基脲六氟磷酸盐）及DIEA，氮气鼓泡反应半小时； d. 抽掉液体，用DMF洗净，茚三酮检测； e. 将树脂用氮气吹干后，从反应柱中取下并称取重量，倒入烧瓶中，然后往烧瓶中加一 定量的95%TFA(三氟乙酸）切割液，震荡反应2h，目的是将多肽从树脂载体上裂解下来并 去除氨基酸的侧链保护基团； f. 滤掉树脂，得到滤液，然后向滤液中加入大量乙醚，析出粗产物，然后离心，清洗即可 得到该序列的粗产物； g. 分析提纯和质谱检测：用ESI(电喷雾电离)离子源质谱仪检测该序列分子量的正确 性，用高效液相色谱将粗品提纯至要求纯度； h. 收集纯化好的目标寡肽溶液放入冻干机中进行浓缩，冻干成白色粉末。
3. -种如权利要求1所述的寡肽在制备抗炎或镇痛药物中的应用。
4. 一种如权利要求1所述的寡肽在制备修复创面药物中的应用。
5. -种如权利要求1所述的寡肽在制备治疗皮肤外伤药物中的应用。
6. -种如权利要求1所述的寡肽在制备治疗消化道溃疡药物中的应用。
7. -种如权利要求1所述的寡肽在制备提高免疫药物中的应用。
8. 权利要求1所述的寡肽可作为普通食品、保健品或者药品的组成部分。
9. 含有权利要求1所述的一种或多种寡肽的组合物，其中含有药学可以接受的载体。
10. 权利要求9所述的组合物可以以药物制剂形式存在，优选的是注射剂，更优选的是 冷冻干燥注射剂，该药物制剂形式药物组合物，可以按照制剂学常规技术制备，包括将药物 活性成分，本发明的寡肽与药物载体混合，按照制剂学常规技术制成所需要的剂型。
【专利摘要】本发明公开了一个小分子寡肽及其制备方法，具体是寡肽CD08及其制备方法和应用,本发明公开了寡肽的氨基酸序列如SEQ ID:1所示，可以采用合成，提取或者基因工程等方式制备寡肽CD08，在制备治疗抗炎镇痛、创面修复以及提高免疫的药物中有较好的治疗效果。
【IPC分类】A23L1-29, C07K5-072, A61P29-00, C07K1-04, A61K38-05, C07K1-06, A61P17-02, A61P37-04, A61P31-00, A61P35-00, A61P1-04
【公开号】CN104817614
【申请号】CN201410044249
【发明人】陈光健
【申请人】陈光健
【公开日】2015年8月5日
【申请日】2014年1月30日