一株用于防治番茄与葡萄根结线虫病害的淡紫拟青霉的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一株用于防治番前与葡萄根结线虫病害的淡紫拟青霉 hVaci/ws)，属于微生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 植物线虫病是农作物、蔬菜、果树、林木、花丼及药材种植的四大病源生物之一，其 危害仅次于真菌，超过细菌和病毒。植物寄生线虫每年造成世界农业生产的损失约1000亿 美元，其中危害最大的一类植物寄生线虫为根结线虫。
[0003] 植物寄生线虫的防治主要有化学杀线虫剂、栽培技术、培育抗性品种和生物农药。 由于根结线虫通常存活于土壤中和植物根内，目前仍无特效的化学农药，只能在短期内控 制线虫病害发生，因此化学农药难以控制其危害，且由于潜在的环境问题，涉及人类和动物 健康，化学杀线虫剂的使用受到很大的限制。此外栽培技术(如轮作)、培育抗性品种等虽然 能够起到一定的防治作用，但是实际应用过程中局限性较大。因此，作为安全、有效的防治 根结线虫病害的方法，生物防治技术及其制剂产品在植物线虫病害防治中的应用就显得尤 为重要。
[0004] 淡紫拟青霉属于半知菌亚门，丛梗抱目，丛梗饱科，拟青霉属，能广泛寄生于线虫 卵，杀虫效果高效，具有安全、高效、持效期长等特点，被认为是最具有应用前景的线虫生防 真菌。淡紫拟青霉除了具有杀线虫效果外，还可以寄生半翅目、同翅目、等翅目和鞘翅目及 鳞翅目等昆虫，对植物病原菌(如玉米小斑病、小麦赤霉病、黄瓜炭疽病菌、棉花枯萎病和水 稻恶苗病等)具有拮抗作用。淡紫拟青霉的次级代谢物也有一定的生理效能，如产生类似吲 哚乙酸产物，促进植物根系和植株生长，对种子萌发和生长具有促进作用，还能产生多种酶 且具有一定的化学农药降解效应。
[0005] 淡紫拟青霉对根结线虫具有侵染力，但是由于生物个体特性的差异，造成不同来 源淡紫拟青霉对根结线虫的防治效果有差异，因此需要不断分离对根结线虫具有更高致病 性的菌株。
【发明内容】
[0006] 本发明提供了一株用于防治番茄与葡萄根结线虫病害的淡紫拟青霉，对番茄和葡 萄根结线虫病具有强致病性，可开发为针对农业根结线虫病的新型生物防治剂。
[0007] 本发明中一株用于防治番茄与葡萄根结线虫病害的淡紫拟青霉为淡紫拟青霉 YT08,其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的 登记入册编号为CGMCCNo. 10026,保藏时间为2014年11月26日。
[0008] 本发明淡紫拟青霉YT08分离自山东省烟台市海水养殖海带表皮，该菌株在分离 培养基上培养，菌落初期为白色且菌丝致密，随着培养时间延长，逐渐变为淡紫色，菌落与 培养基连接紧密，不易挑取。该菌株产分生孢子，孢子呈椭圆形，分生孢子梗呈扫帚状。
[0009] 本发明淡紫拟青霉YT08对氯霉素不敏感，营养要求低，在啤酒糟固体培养基上生 长良好，且在20°C- 35°C均能正常培养。
[0010] 本发明淡紫拟青霉YT08对番茄和葡萄根结线虫病具有强防治效果，盆栽试验中 对番茄根结线虫的防治效果为89. 69%，对葡萄根结线虫的防治效果为93. 42%。
[0011] 本发明淡紫拟青霉YT08属于拟青霉属淡紫拟青霉种 iPaecilotnyceslilacinus)。
[0012] 生物材料信息： 分类命名：淡紫拟青霉
[0013] 菌株编号：YT08。
[0014] 保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
[0015] 保藏机构简称：CGMCC。
[0016] 地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0017] 保藏日期：2014年11月26日。
[0018] 保藏中心登记入册编号：CGMCCNo. 10026。
【附图说明】
[0019]图1为淡紫拟青霉YT08在分离培养基上的培养特征；图2为淡紫拟青霉YT08的 显微镜形态观察特征。
[0020]
【具体实施方式】
[0021] 下面结合具体实施例对本发明做进一步描述，这些实施例用于理解而不是限制本 发明。
[0022] -株用于防治番茄与葡萄根结线虫病害的淡紫拟青霉，菌种命名为YT08,分类命 名：淡紫拟青霉其保藏编号：CGMCCNo. 10026,保藏单位：中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3 号，保藏日期：2014年11月26日。
[0023] 实施例1:菌株YT08的分离筛选 淡紫拟青霉YT08由中国山东省烟台市海水养殖的海带表皮中分离得到。分离筛选按 照以下步骤进行：将采集的海带样本按照1:100的比例加入无菌水稀释，在28°C的恒温摇 床中振摇30分钟，在超净工作台上经逐级稀释后涂布筛选培养基平板上，28°C的恒温摇床 4一6天至长出单菌落，挑取单菌落在分离培养基平板上进行多次划线分离纯化，经显微镜 镜检为纯培养后，转接孟加拉红固体斜面培养基，28°C的恒温摇床培养4一6天置于4°C下 保存，即为淡紫拟青霉YT08。
[0024] 所用筛选培养基组分如下：硫酸铵10g/L，磷酸氢二钾2g/L，氯化钠15g/L，七 水硫酸镁1g/L，胶体壳聚糖100g/L，琼脂20g/L，pH5.8，121°C灭菌20分钟。
[0025] 所用的分离培养基组分如下：葡萄糖30g/L，硝酸钠2g/L，磷酸氢二钾1g/L，硫 酸铁〇? 01g/L，氯化钾0? 5g/L，七水硫酸镁0? 5g/L，胶体壳聚糖6g/L，琼脂20g/L，pH 6. 5,121 °C灭菌20分钟。
[0026] 菌种保藏用的孟加拉红培养基组分如下：蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，磷酸二 氢钾1g/L，七水硫酸镁0. 5g/L，琼脂粉20g/L，孟加拉红0. 0133g/L，氯霉素0. 1g/L，pH6. 5,121°C灭菌 20 分钟。
[0027] 实施例2:菌株YT08的菌属鉴定 1.菌株YT08的形态特征：将上述分离筛选的菌株YT08划线接种于分离培养基上， 28°C的恒温摇床培养，定期观察菌落生长状态。将菌株采用涂布法接种另一分离培养基中， 同时将灭菌后的盖玻片（lcmXlcm)斜插入培养基中，置于28°C的恒温培养箱中培养6天待 菌丝爬到盖玻片上后，取出盖玻片置于光学显微镜下观察菌株YT08的菌丝和孢子形态。
[0028] 菌株YT08在培养初期菌落颜色为白色，随着培养时间延长后颜色逐渐加深，产生 孢子后菌落颜色显示为淡紫色。图1所示为菌株YT08在分离培养基上培养6天后的形态 特征，菌落呈现隆起状圆形，，菌落与培养基连接紧密，不易挑取，菌丝致密且向外扩散，颜 色为淡紫色，周围略显白色，不分泌可溶性色素。显微镜下观察到的菌株YT08形态特征见 图2,其分生孢子梗呈扫帚状，孢子呈椭圆形，成串呈不分枝的链状，基内菌丝呈浅褐色。
[0029] 2.菌株YT08的18SrDNA序列分析 提取菌株YT08的总DNA，采用真菌18SrDNA的通用引物（NS1-5,-GTAGTCATATGCTTGT CTC-3 '，NS6-5 ' -GCATCACAGACCTGTTAITGCCTC-3 '）进行PCR扩增，PCR产物经琼脂糖凝胶电 泳，由PCR产物电泳结果切割所需DNA目的条带，利用凝胶回收试剂盒回收后送交公司测 序。
[0030] 测序所得菌株YT08的18SrDNA序列如序列表所示，经过NCBIBlast比对分析，该 序列与GenBank中淡紫拟青霉的多个分离物（如JF824691. 1、 AB124670.UAY526475. 2.AB084157.UAB104884.UAB023945.UEF638694.UAB103380.U AF548079. 1等）的序列相似性高达100%。
[0031] 通过结合关于菌株YT08的形态特征及18SrDNA序列特征，可将菌株YT08鉴定为 '後繁拟着霉QPaecilomyceslilacinus)。
[0032] 实施例3:淡紫拟青霉YT08的发酵培养 1.菌种活化培养 每500ml三角烧瓶中加入100ml的菌种活化培养基，121°C蒸汽灭菌20分钟。所用的 菌种活化培养基组成（g/L):甘油10,大豆蛋白胨15,MnS04 2,85%脱乙酰度的粉末壳聚糖 8，NaCl6，CaCl2l，MgS04 3，FeS04 0.5,初始pH7。
[0033] 从固体斜面菌种中挑出一小块菌苔，直接接入液体的菌种活化培养基，在28°C和 200rpm下摇床振摇培养48小时，至长成浅白色粘稠菌丝体。
[0034] 2.固体发酵培养 固体发酵培养基：干啤酒糟3kg，蔗糖20g，大豆蛋白胨60g，85%脱乙酰度的粉末壳聚 糖10g，NaCl30g，MgS04 6g，MnS04 4g，用自来水定容至7升。配制方法：先用水将NaCl、 MgS04、MnS04、蔗糖和大豆蛋白胨溶解，搅拌均匀，再与其他物质混匀，pH自然。将上述固体 发酵培养基装入10L固体发酵罐中，118°C下蒸汽灭菌20分钟。
[0035] 按照10% (体积百分比）接种量，将淡紫拟青霉YT08的种子培养产物倒入固体发 酵培养基中，启动机械搅拌使菌种与发酵培养基混匀。在28°C下静态培养，每隔3小时通入 无菌空气1次。培养3天后至培养基表层长满菌丝，再次启动机械搅拌将发酵罐中所有物 质捣碎混匀，在28°C下静态培养，每隔5小时通入无菌空气1次，继续培养4天后至培养基 上长满淡紫色孢子后终止发酵。
[0036] 发酵终止后启动机械搅拌装置，将培养物打散混匀，从出料口取出，放入阴凉通风 处晾干，即得淡紫拟青霉YT08的固体制剂。采用逐级稀释涂布方法，在孟加拉红培养基上 检测发现固体制剂中淡紫拟青霉YT08的活菌数为4. 7X109cfu/g。
[0037] 实施例4:淡紫拟青霉YT08对番茄根结线虫卵的寄生性 设处理组和对照组，每组设置3个重复(培养皿)。在无菌培养皿中加入2mL卵粒悬浮 液，其中处理组的每个培养皿中另加2mL淡紫拟青霉YT08孢子悬浮液，对照组的每个培养 皿中另加2mL无菌水。28°C下培养8天后，按照下式计算卵孵化率和卵寄生率：
【主权项】
1. 一株用于防治番茄与葡萄根结线虫病害的淡紫拟青霉，其特征在于该菌株为淡紫拟 青霉（YT08,是从山东省烟台市海水养殖的海带表皮中分离获得 的，对番茄和葡萄根结根结线虫病具有强防治效果，已于2014年11月26日在中国微生物 菌种保藏委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCCNo. 10026。
【专利摘要】本发明公开了一株用于防治番茄与葡萄根结线虫病的淡紫拟青霉。本发明所提供的淡紫拟青霉是所述淡紫拟青霉YT08，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.10026，保藏日期为2014年11月26日。本发明提供的淡紫拟青霉YT08 CGMCC No.10026对番茄和葡萄根结线虫具有强防治效果，可开发为针对农业根结线虫病的新型生物防治剂。CGMCC No.1002620141126
【IPC分类】C12R1-79, A01P5-00, C12N1-14
【公开号】CN104818216
【申请号】CN201510026764
【发明人】程仕伟, 刘树朋, 张萍
【申请人】鲁东大学
【公开日】2015年8月5日
【申请日】2015年1月20日