低温蛋白酶生产菌及该菌产生的低温蛋白酶和该酶的基因的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物及微生物酶制剂领域，具体涉及一株来源于深海沉积物的低温 蛋白酶产生菌、所产蛋白酶以及利用该菌株产生低温蛋白酶的方法。
【背景技术】
[0002] 低温蛋白酶是指最适催化温度在40°C以下，并且在20~30°C之间仍能保持较高 酶活（50 %以上）的一类蛋白水解酶，由于其最适催化温度接近自然环境中的温度，因此在 应用过程中可省去加热或冷却过程，与中高温蛋白酶相比具有节能、省时等特点，在食品及 洗涤行业具有广泛的应用前景。低温蛋白酶多数来源于冰川、极地、高山、深海等低温环境 中的嗜低温或耐低温微生物。这些低温微生物为了适应其所处的低温环境，常可表达分泌 一些在低温条件下仍具有较高催化活性的胞外酶或胞内酶，因此从耐低温或嗜低温微生物 中，筛选获得低温蛋白酶已成为发掘新型工业用低温酶制剂的主要方法。
[0003]目前已发现的产低温蛋白酶菌株有来源于冰川冻土中的地衣芽孢杆菌 (Bacilluslicheniformis)和短小杆菌（Curtobacteriumluteum)、来源于南极地区 的梭状芽抱杆菌（Clostridiumsp.)和嗜冷杆菌（Psychrobacterproteolyticus)、 来源于海洋浮冰中的科尔韦尔氏菌属（Colwelliasp.)、来源于寒漠地区的微小杆菌 (Exiguobacteriumsp.)以及来源于其它寒冷环境中的沙雷氏菌（Serratiasp.)、弧菌 (Vibriosp.)、黄单胞菌（Xanthomonasmaltophilia)、希瓦氏菌属（Shewanellasp.)产黄 青霉（Penicilliumchrysogenum)等。这些菌株所产低温蛋白酶的最适催化温度大部分均 在30~40°C之间，只有少数几种的最适催化温度低于20°C，但稳定性很差。
[0004] 国内对低温蛋白酶及其产生菌的研宄起步较晚，研宄对象多集中在来源于冰川及 冻土中的Pseudomonas属、Xanthomonas属、Aeromonas属等。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种低温蛋白酶生产菌及该菌产生的低温蛋白酶和该 酶的基因，该菌株来源于南印度洋深海沉积物，经16SrRNA序列分析，鉴定为动性球菌 (Planococcussp.)，该酶基因序列见序列1，该菌株保藏编号为：CGMCCNo. 8088,本菌株作 为低温蛋白酶生产菌株具有较大的优势，具有发酵条件易于控制、发酵原料简单易得、生长 快、发酵周期短、抗噬菌体及杂菌污染的能力较强、菌株产酶较为稳定的显著优点。
[0006] 本发明实现目的的技术方案是：
[0007] -株低温蛋白酶生产菌，所述菌株保藏日期为2013年08月29日，保藏单位为：中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNo. 8088,地址：北京市 朝阳区北辰西路1号院3号，分类命名为：动性球菌Planococcussp.。
[0008] 而且，所述菌株能够利用葡萄糖、果糖、淀粉作为碳源，能够利用硫酸铵、蛋白胨、 水解酪蛋白作为氮源；具有氧化酶、过氧化氢酶活性，明胶液化实验呈阳性，在含有酪蛋白 的4~20°C低温平板上产生明显的透明圈。
[0009] -种低温蛋白酶基因，其成熟肽编码序列、信号肽编码序列以及编码区上游的部 分表达调控序列如序列1所示。
[0010] 一种低温蛋白酶，由低温蛋白酶生产菌菌株发酵获得。
[0011] 一种低温蛋白酶，经由序列1所述的基因表达获得。
[0012] 一种产低温蛋白酶的基因工程，含有序列1所述的低温蛋白酶基因。
[0013] 本发明的优点和有益效果为：
[0014] 1、本菌株作为低温蛋白酶生产菌株具有较大的优势：⑴发酵条件易于控制，该菌 株的最适生长温度与最佳产酶温度均接近于自然环境中的温度，因此在发酵过程中可省去 加热或冷却的过程，另外，该菌株的生长受pH值影响较小，在pH6. 0-8. 0之间均可稳定生长 并产酶；⑵发酵原料简单易得，蛋白酶产量高，该菌株可在含有酪蛋白及海盐的培养基上进 行快速生长繁殖，摇瓶发酵48h蛋白酶产量可达280-360U/mL;(3)生长快、发酵周期短，该菌 株在适宜生长条件下的代时约为30-40min，可与大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等快速繁殖菌种 相媲美；⑷抗噬菌体及杂菌污染的能力较强；(5)菌株产酶较为稳定，产酶量基本与菌体生 长量成正比。
[0015] 2、从对该菌株所产蛋白酶的酶学性质分析结果来看，该菌株所产蛋白酶应属典 型的丝氨酸蛋白酶，其最适催化温度为37°C左右，在25-30°C之间可保持较高的催化活 性；由于人体的正常温度也在36-37°C之间，因此在牙膏或化妆品中添加该酶有望起到最 佳催化效果；该酶属典型的低温蛋白酶，与中/高温蛋白酶相比，热稳定性较差，50°C仅保 温1.Omin，则酶活完全丧失；该特性尽管不利于酶的储存和运输，但在食品、啤酒及奶制 品加工工业中却有着较大的应用前景，因为在其加工过程中，往往需要蛋白酶的灭活以保 证食品、啤酒及奶制品的风味和质量；中高温蛋白酶的灭活非常困难往往需要较高的温度 和较长的时间，对产品影响较大；而低温蛋白酶，则只需较低的温度（50°C)和较短的时间 (l-5min)就可使蛋白酶完全失活，因此低温蛋白酶的使用不仅节能、省时，还可充分保障食 品、啤酒及奶制品中的独特风味和质量。
【附图说明】
[0016]图1为本发明蛋白酶的最适作用温度；
[0017] 图2为本发明蛋白酶的最适作用pH;
[0018] 图3为本发明蛋白酶的热稳定性。
【具体实施方式】
[0019] 下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限 定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
[0020] -、菌株状态说明：本发明提供一种可高产低温蛋白酶的海洋细菌动性球菌 TCCC11813 (CGMCCNo. 8088)。该菌株来源于南印度洋深海沉积物，经16SrRNA序列分析，鉴 定为动性球菌（Planococcussp.)。该菌株革兰氏染色呈阳性，球形或卵圆形，直径约0. 5~ 2. 5ym，双球状或连珠状排列；菌落形态圆形、颜色橙黄色，表面光滑、边缘齐整。可较好利 用葡萄糖、果糖、淀粉等碳源，能够利用硫酸铵、蛋白胨、水解酪蛋白等氮源；具有氧化酶、 过氧化氢酶活性，明胶液化实验呈阳性，在含有酪蛋白的低温平板上（4~20°C)可产生明 显的透明圈。该菌株已于2013年08月29日保存于中国科学院微生物研宄所中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNo. 8088,地址：北京市朝阳区北 辰西路1号院3号。本发明所涉及的低温蛋白酶产生菌可以是自然筛选的原始菌株，也可 以是通过自然变异或人工诱导变异的变异本菌株产生的低温蛋白酶。
[0021] 二、菌株产酶特性说明：本发明的动性球菌TCCC11813可发酵产生低温蛋白酶，其 酶学特征为：最适反应温度在35~37°C之间，并且在25-40°C之间均有较好的催化活性 (最高催化酶活的50%以上），温度高于50°C，酶活基本丧失，表现出明显的低温蛋白酶特 性；酶的热稳定性研宄表明：该菌株所产蛋白酶的热稳定性较低，45°C保温60min，则酶活 仅剩原来的10%，50°C保温lmin，则催化活性完全丧失，10°C以下保温lh，酶活仍保持在 90%以上。该酶在pH4. 0-10.OpH范围内均具有催化活力，其最适作用pH为8.0左右；当 pH值升至9. 0时，其酶活约为最高酶活的70%左右，当pH值升至10. 0时，酶活大幅下降， 仅为最高酶活的25%;当pH值降至7. 0时，酶活力约为最高活力的82%。因此该菌株所产 蛋白酶为低温碱性蛋白酶。金属离子Ca2+对该菌株所产蛋白酶有激活作用，Mn2+对其基本 没有影响；Mg2+、Ba2+、Fe3+、Zn2+、Co2+、Zn2+则对其有一定的抑制作用，Ni2+对其抑制作用最 强，浓度为1.Ommol/L的Ni2+可抑制90%以上的酶活，因此组氨酸可能是该酶的活性中心 之一；EDTA对该酶有一定抑制作用，某些金属离子可能对维持酶分子的三维结构有重要作 用；另外该酶被DEPC、PMSF、EDAC强烈抑制，因此该菌株所产蛋白酶的活性位点应包括His、 Ser以及羧基氨基酸。从上述分析结果推测，该菌株所产蛋白酶应属于丝氨酸蛋白水解酶， 并且含有典型的由His、Ser以及Asp组成的催化活性中心结构。
[0022] 三、所产低温蛋白酶基因特性说明：从该动性球菌TCCC11813菌株的基因组中获 得了一种低温蛋白酶编码基因，其成熟肽编码序列、信号肽编码序列以及编码区上游的部 分表达调控序列如序列1所示；序列分析结果显示：该基因为新型蛋白酶编码基因，其编码 的氨基酸序列与目前数据库中已发表的蛋白序列相比，最高同源性仅为75%左右。可通过 分子生物学技术从原始菌株中克隆低温蛋白酶编码基因，并使其在特定宿主中实现功能表 达。
[0023] 16srDNA测序引物：
[0024] 16SrDNAF:5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'
[0025] 16SrDNAR:5' -GGTTACCTTGTTACGACTT-3'
[0026] 16srDNA测序结果：
[0027]
【主权项】
1. 一株低温蛋白酶生产菌，其特征在于：所述菌株保藏日期为2013年08月29日，保 藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNo. 8088， 地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类命名为：动性球菌Planococcussp.。
2. 根据权利要求1所述的低温蛋白酶生产菌，其特征在于：所述菌株能够利用葡萄糖、 果糖、淀粉作为碳源，能够利用硫酸铵、蛋白胨、水解酪蛋白作为氮源；具有氧化酶、过氧化 氢酶活性，明胶液化实验呈阳性，在含有酪蛋白的4~20°C低温平板上产生明显的透明圈。
3. -种低温蛋白酶基因，其特征在于：其成熟肽编码序列、信号肽编码序列以及编码 区上游的部分表达调控序列如序列1所示。
4. 一种低温蛋白酶，其特征在于：由权利要求1所述的菌株发酵获得。
5. -种低温蛋白酶，其特征在于：经由权利要求3所述的基因表达获得。
6. -种产低温蛋白酶的基因工程，其特征在于：含有权利要求3所述的低温蛋白酶基 因。
【专利摘要】本发明涉及一种低温蛋白酶生产菌及该菌产生的低温蛋白酶和该酶的基因，首次从南印度洋深海沉积物中分离到一株产低温蛋白酶动性球菌Planococcus sp.菌种保藏编号为：CGMCC No.8088，菌株的最适生长温度及最佳产酶温度均为20℃，发酵水平的蛋白酶产量可达280U/mL；该菌株所产蛋白酶的最适作用温度为在30～37℃之间，最适pH为7.5～9.0，30℃条件下可保持最高催化活力的80％以上，而在20～25℃之间仍具有较高的催化活力；该菌株所产蛋白酶属于典型的低温碱性蛋白酶，在常温下具有较好的催化活性，因此在食品加工业及冷水洗涤剂开发等方面具有较高的研究价值。CGMCC No.808820130829
【IPC分类】C12R1-01, C12N1-20, C12N9-52, C12N15-57
【公开号】CN104818225
【申请号】CN201510105290
【发明人】张会图, 路福平, 莫清珊
【申请人】天津科技大学
【公开日】2015年8月5日
【申请日】2015年3月10日